近日，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室王阳副研究员课题组在Chemical Engineering Journal发表题为“Characterization and Engineering of Carbohydrate-Binding Modules from Novel PaenibacillusPolysaccharide Lyases for in situ Glycosaminoglycans Visualization”的研究论文。该研究从新型多糖裂解酶中挖掘具有糖胺聚糖（glycosaminoglycans）结合能力的碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding module，CBM），解析其底物识别特性及分子机制，并进一步构建荧光探针，实现了糖胺聚糖的原位可视化。江南大学2022级博士生孙亚楠为论文第一作者，堵国成教授和王阳副研究员为论文共同通讯作者。

糖胺聚糖是一类广泛存在于动物组织和细胞外基质中的酸性多糖，在组织结构维持、细胞黏附及信号传递等生物过程中发挥重要作用。开发具有良好结合特性和可工程化能力的识别元件，对于糖胺聚糖的检测分析具有重要意义。研究团队从Paenibacillus chondroitinus鉴定了两种新型糖胺聚糖裂解酶PC_PL8_1和PC_PL8_2，并进一步对其碳水化合物结合模块CBM开展功能解析。结果表明，CBM可增强相应裂解酶的活性，在底物识别与酶催化过程中具有重要作用。进一步研究发现，两种CBM结构域均能独立结合糖胺聚糖，并表现出对软骨素（chondroitin）的高亲和力，其K_d分别为4.26 ± 0.53 μM和3.65 ± 0.55 μM。

为解析CBM识别糖胺聚糖的分子基础，研究团队结合分子对接、分子动力学模拟及定点突变等方法，对CBM与多糖底物之间的相互作用进行了系统分析。研究发现，CBM与糖胺聚糖之间存在多种协同作用，包括静电相互作用和氢键等，并鉴定了参与结合的关键氨基酸残基，揭示了新型CBM识别糖胺聚糖的结构基础。研究团队进一步对PC_PL8_2的CBM进行工程化改造，将PC_PL8_2-CBM与荧光蛋白融合，构建了基于CBM的荧光探针。开发的探针能够识别动物组织和微生物细胞表面的糖胺聚糖，为该类多糖的检测、合成菌种筛选和生物制造过程监测提供了新的技术手段。

上述研究由国家自然科学基金项目（32370079、32000058）资助。

图1 PC_PL8_1和PC_PL8_2裂解酶的糖胺聚糖降解活性分析

图2 PC_PL8_1和PC_PL8_2裂解酶截短突变体的酶学性质分析

图3 裂解酶中两种CBM的蛋白结构及底物结合特性分析

图4 两种CBM与不同底物结合特性的等温滴定量热（ITC）分析

图5 两种CBM关键底物结合残基的鉴定与功能验证

图6 CBM荧光探针用于动物组织和微生物表面糖胺聚糖的原位可视化