一、文章基本信息

·      标题：Plasmid- and Inducer-Free Biosynthesis of Difucosyllactose through Rational Fusion Enzyme Engineering and Systematic Pathway Optimization

·      作者：Zhiqiang Liu, Binglin Li, Jieying Deng, Yanfeng Liu, Jianghua Li, Guocheng Du, Jian Chen, Xueqin Lv, Xianhao Xu, Long Liu

·      期刊：ACS Synthetic Biology, 2026

·      研究团队：江南大学（食品科学与技术未来中心、糖化学与生物技术教育部重点实验室）

·      通讯作者：Xianhao Xu、Long Liu（刘龙）（江南大学）

·      DOI：10.1021/acssynbio.6c00229

·      期刊信息：ACS Synthetic Biology是合成生物学领域的顶级期刊，致力于发表合成生物学、代谢工程及生物系统设计等方向的前沿研究成果。

二、研究要点

1. 构建无质粒、无诱导剂的大肠杆菌DFL从头合成平台：DFL（双岩藻糖基乳糖）是一种具有重要益生功能的母乳寡糖，对预防新生儿败血症具有独特抗菌活性。本研究以2‘-FL生产菌株MGF6为底盘，系统筛选6种异源α-1,3-岩藻糖基转移酶（α-1,3-FucT），其中FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ突变体表现最优，DFL产量达1.25 g/L。整个生产过程无需抗生素和诱导剂，消除了质粒不稳定性和高昂成本等工业应用障碍。

2. 基因组整合位点系统性筛选揭示超过5倍的表达差异：在大肠杆菌MG1655基因组中选取10个位点，分别整合futC（α-1,2-FucT）和fucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ（α-1,3-FucT）。不同位点的2‘-FL产量从0.62到3.19 g/L不等，3-FL产量从0.39到1.94 g/L不等，差异均超过5倍。yjiR、asl和nupG三个位点对两种酶均表现优异，被确定为“通用高表达位点”。通过优化fucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ与futC的基因拷贝数比例（1:1），DFL产量提升至4.22 g/L。

3. iMARS框架指导融合酶设计有效抑制中间体积累：中间体2‘-FL的积累是DFL生产的主要瓶颈。本研究利用iMARS（in silico multienzyme assembling by reshaping space）计算框架，通过预测连续酶之间的通道距离（D_IC）和通道方向/角度（O_IC）生成DO评分，从100种连接肽设计中筛选出最优融合酶FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ-L₆₀-FutC。三拷贝融合酶菌株MGD22的DFL产量达4.97 g/L，中间体2’-FL仅63 mg/L，较游离酶组合（MGD12，2.43 g/L 2‘-FL）降低38.6倍。

4. 半理性改造底物结合口袋提升酶与2’-FL的亲和力：基于FucT晶体结构信息，对FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ底物结合口袋附近的4个疏水残基（A29、W31、W32、P33）进行定点突变。W31R突变体（m3）使DFL产量提升11%至5.52 g/L。体外酶活测定显示FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ/ᵂ³¹ᴿ的比活达2.05±0.16 U/mg，为亲本酶（1.12±0.09 U/mg）的1.83倍。分子动力学模拟表明W31R突变使酶-底物复合物在40 ns后达到稳定平衡，而亲本酶在整个100 ns模拟中持续波动无法达到平衡。

5. 乳糖操纵子工程解除生长抑制并提升产量：初始菌株MGD31在5 L罐中前期生长缓慢——初始葡萄糖耗尽需18 h，12 h时OD₆₀₀仅3.5。研究发现强组成型启动子P₂₃₁₁₉驱动的lacY过表达干扰了细胞膜装配。通过敲除lacI阻遏蛋白基因，利用天然lac启动子调控lacY表达，菌株MGD43的DFL产量在摇瓶中达7.1 g/L（较MGD31提升28%），且初始生长显著加快。

6. 5 L发酵罐中DFL产量达74 g/L，生产强度0.96 g/L/h创纪录：MGD43在5 L补料分批发酵中，77 h DFL产量达74 g/L，葡萄糖得率0.28 g/g，生产强度0.96 g/L/h。与已有报道相比：质粒依赖型体系最高55.3 g/L，无质粒多拷贝整合体系35.04 g/L，本研究产量分别提升34%和111%。中间体2‘-FL仅占总岩藻糖基化寡糖的2.1%（1.595 g/L），产品纯度显著优于已有报道。

三、图表解读

Figure 1. DFL在大肠杆菌中的从头合成途径与α-1,3-FucT筛选

▎核心发现

图1A展示了DFL的完整生物合成途径：葡萄糖经果糖-6-磷酸途径生成GDP-L-岩藻糖，α-1,2-FucT（FutC）催化GDP-L-岩藻糖与乳糖连接生成2‘-FL，α-1,3-FucT（FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ）再将第二个岩藻糖基转移至2’-FL的3位生成DFL。图1B展示了fucT基因在betA位点的基因组整合策略。图1C比较了6种α-1,3-FucT的表达效果——FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ表现最优（DFL 1.25 g/L），FutAM32突变体和m3FT也表现出一定活性，而FutM和Fut3Bc活性较低。

▎机制解析

DFL的生物合成需要两种岩藻糖基转移酶的序贯催化。α-1,2-FucT（FutC）是第一步反应的催化剂，将岩藻糖基连接到乳糖的2‘位；α-1,3-FucT（FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ）负责第二步，将第二个岩藻糖基连接到2’-FL的3位。FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ的优越性源于其Y218K突变——该突变增强了酶与底物2‘-FL的结合亲和力，使其更高效地完成第二步反应。不同酶来源的活性差异反映了α-1,3-FucT家族在底物特异性和催化效率上的种属特异性。

▎工程启示

“序贯反应中第二步酶的催化效率决定了最终产物的积累”——DFL生产中2’-FL的大量积累（MGD2中2‘-FL远高于DFL）表明α-1,3-FucT是整个途径的限速步骤。工程化改造应从限速酶入手，而非平均用力。

Figure 2. 组合代谢工程提升DFL产量

▎核心发现

图2A展示了MG1655基因组及本研究使用的整合位点。图2B显示futC在不同位点整合后2‘-FL产量差异——betA（3.19 g/L）、nupG（2.94 g/L）、nhaR（2.88 g/L）等位点表现最优，差异超过5倍。图2C显示fucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ在不同位点整合后3-FL产量差异——yjiR（1.94 g/L）、asl（1.81 g/L）、nupG（1.79 g/L）等位点表现最优。图2D展示了基因拷贝数优化和setA/mdfA敲除的效果——MGD12（fucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ和futC各3拷贝）DFL产量达4.22 g/L；setA和mdfA敲除虽消除了2‘-FL积累，但DFL产量骤降至0.35 g/L。

▎机制解析

超过5倍的位点间表达差异源于局部染色体环境——DNA超螺旋状态、相邻基因的转录干扰以及局部调控元件的存在共同决定了整合基因的实际表达水平。yjiR、asl和nupG三个位点在两种酶中均表现优异，说明这些位点所在的染色体区域具有“转录友好”的微环境。setA和mdfA敲除导致DFL产量骤降的原因可能是：①胞内2‘-FL积累对途径产生反馈抑制；②SetA和MdfA可能同时负责DFL的外排，其敲除导致DFL胞内积累和反馈抑制。

▎工程启示

“整合位点选择是决定基因表达水平的‘第一颗扣子’”——在无质粒体系中，基因组整合位点的选择直接影响基因表达水平、代谢负担和菌株稳定性。不同位点间超过5倍的产量差异意味着：选错位点可能抵消所有其他工程改造的收益。

Figure 3. iMARS指导的融合酶空间优化

▎核心发现

图3A展示了iMARS计算的DO评分在100种连接肽中的分布——高DO评分代表连续酶之间更优的空间排布，可最大限度减少中间体扩散。图3B展示了筛选出的5种融合酶设计。图3C显示FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ-L₆₀-FutC融合酶（MGD16）使DFL产量达1.25 g/L，且中间体2‘-FL几乎检测不到。图3D的Western blot验证了所有融合酶的成功表达且表达水平相当。图3E显示三拷贝融合酶菌株MGD22的DFL产量达4.97 g/L，2’-FL仅63 mg/L。图3F显示5种柔性连接肽替换（FL1-FL5）效果均不及L₆₀。

▎机制解析

iMARS的核心计算逻辑是：通过预测连续酶之间的“通道距离”（D_IC）和“通道方向/角度”（O_IC）来量化中间体从酶1活性中心到酶2活性中心的扩散效率。DO评分越高，中间体越难“逃逸”到周围溶剂中，越容易被酶2捕获。L₆₀连接肽（15个氨基酸，GPGGD三重复）的成功源于其既提供了足够的柔性允许两个酶结构域相对运动，又保持了适中的刚性防止中间体扩散通道的过度开放。Western blot验证了所有融合酶表达水平相当，排除了表达量差异对结果的干扰。

▎工程启示

“将连续酶物理连接可使中间体‘无处可逃’”——融合酶策略的本质是“底物通道化”——中间体从酶1产生后被直接“传递”给酶2，无需扩散到胞质中。这一策略对于存在有毒或反馈抑制中间体的途径尤为有效。

Figure 4. FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ的结构指导改造

▎核心发现

图4A显示8个突变体中仅W31R（m3）显著提升DFL产量（5.52 g/L，较对照提升11%），而W31H、W32R和W32H完全丧失活性。图4B的Western blot显示FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ和FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ/ᵂ³¹ᴿ表达水平相当。图4C显示突变体比活（2.05 U/mg）为亲本（1.12 U/mg）的1.83倍。图4D的RMSD轨迹显示突变体在40 ns后达到稳定平衡（~2.5 Å），而亲本在整个100 ns中持续波动。图4E-F显示突变体-2‘-FL复合物在40 ns后形成稳定结合，而亲本-底物复合物无法维持稳定。

▎机制解析

W31位于底物结合口袋的入口处，其较大的疏水侧链可能阻碍水溶性底物2‘-FL进入活性中心。突变为精氨酸后：①精氨酸的带电胍基增加了结合口袋入口的亲水性，有利于2’-FL的进入；②精氨酸与周围残基形成新的氢键网络，稳定了结合口袋的构象。MD模拟中突变体RMSD在40 ns后稳定而亲本持续波动，表明W31R突变增强了整个蛋白的结构刚性。突变体-底物复合物的稳定结合进一步证实了亲和力的提升。

▎工程启示

“底物结合口袋入口的疏水残基是改造的‘低垂果实’”——对于水溶性底物，结合口袋入口处的疏水残基往往构成底物进入的屏障。将其突变为亲水或带电残基可降低底物进入的能垒，是提升酶活性的高效策略。

Figure 5. 乳糖操纵子工程与5 L发酵放大

▎核心发现

图5A-B展示了乳糖操纵子的调控机制及启动子替换方案。图5C显示敲除lacI阻遏蛋白、利用天然lac启动子调控lacY表达的菌株MGD43，摇瓶DFL产量达7.1 g/L（OD₆₀₀ 10.44），优于所有外源启动子替换方案。图6的5 L发酵曲线显示MGD43在77 h DFL产量达74 g/L，OD₆₀₀达~130，葡萄糖完全消耗仅需8 h（MGD31需18 h）。DFL生产强度0.96 g/L/h，葡萄糖得率0.28 g/g。

▎机制解析

MGD31中强组成型启动子P₂₃₁₁₉驱动lacY的高水平表达导致了“膜蛋白过表达综合征”——LacY作为跨膜蛋白，其过量合成干扰了细胞膜的正常装配，影响了营养摄取和物质外排【8†L17-L18】。lacI敲除后，天然lac启动子（受lacO调控）在无诱导剂条件下处于“去抑制”状态，但表达水平远低于强组成型启动子，恰好提供了“充足但不超载”的乳糖通透酶水平。有趣的是，MGD43的最终生物量（OD₆₀₀~130）远低于MGD31（OD₆₀₀~217），但DFL产量却更高——表明DFL的高效合成本身就是一种“代谢负担”，抑制了过度生长。

▎工程启示

“不是越强越好——启动子强度需要‘恰到好处’”——膜蛋白的过表达对细胞造成的负担远大于胞内蛋白。对于lacY这类膜蛋白，强启动子并非最优选择，“足够但不过量”的表达水平才能实现生长与生产的平衡。

四、启示与思考

融合酶设计的“空间算法”——从“试错”到“计算”的范式升级

传统融合酶设计依赖经验性连接肽选择——通常测试几种常见的柔性或刚性连接肽（如(GGGGS)ₙ、EAAAK等），再通过实验筛选最优者。这种方法效率低且缺乏理性指导。iMARS通过计算连续酶之间的“通道距离”和“通道方向”来量化中间体扩散效率，从100种连接肽设计中精准锁定最优方案。这一“空间算法”的本质是将蛋白质工程问题转化为几何优化问题——不再问“哪种连接肽最好”，而是问“哪种连接肽能让两个活性中心靠得最近、对得最准”。这一思路可推广至任何涉及序贯反应的多酶级联体系。

“无质粒”不是目的，而是解锁工业可行性的钥匙

质粒依赖型表达系统在实验室研究中被广泛使用，但其工业应用面临三重障碍：①抗生素添加增加成本且不符合食品级产品法规；②诱导剂（如IPTG）昂贵且有毒；③质粒在无选择压力下易丢失，导致批次间不稳定。本研究通过基因组整合实现了遗传稳定、无需抗生素和诱导剂的生产体系。这一“无质粒”设计不仅是技术选择，更是从“实验室可行性”到“工业可行性”跨越的必经之路。对于食品和医药级产品（如母乳寡糖），无抗生素、无诱导剂的生产体系是商业化的基本前提。

“中间体问题”的本质是“通量不匹配”——融合酶提供了拓扑学解决方案

DFL生产中2‘-FL的积累是序贯反应中典型的“通量不匹配”问题——第一步反应（FutC）的速率远高于第二步（FucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ），导致中间体“拥堵”。传统解决方案是过表达第二步酶，但受限于酶本身的催化效率，效果有限。融合酶策略提供了一个“拓扑学”解决方案——不改变酶的催化速率，而是改变中间体的“命运”——使其从“扩散到胞质”变为“直接传递到下一个活性中心”。融合酶菌株MGD22的2‘-FL从2.43 g/L降至63 mg/L（降低38.6倍），证明了“底物通道化”在解决通量不匹配问题上的独特优势。

从“质粒高拷贝”到“基因组多拷贝”——拷贝数存在最优区间

本研究在基因组整合fucTaᴬ⟡¹⁸ᴷ和futC时发现，拷贝数从2增至3时DFL产量提升（1.91→4.22 g/L），但从3增至4时反而下降（4.22→2.43 g/L）。这一“倒U型”关系揭示了基因组多拷贝整合的“最优区间”——拷贝数不足时酶量受限，拷贝数过高时代谢负担加重（OD₆₀₀下降）。与质粒体系不同，基因组整合的拷贝数无法通过改变复制起点随意调节，因此确定“最优拷贝数”更为关键。这一原则对任何无质粒细胞工厂的多拷贝基因整合都具有普遍指导意义。

从“产量导向”到“纯度导向”——DFL生产的新评价维度

传统DFL生产研究以产量为唯一评价指标，忽视了中间体2‘-FL的积累对下游分离纯化的影响。2’-FL与DFL结构相似（仅差一个岩藻糖基），分离极为困难，大量2‘-FL残留意味着高昂的纯化成本。本研究通过融合酶策略将2’-FL从2.43 g/L降至63 mg/L（摇瓶）和1.595 g/L（发酵罐，仅占总寡糖的2.1%），显著提升了产品纯度。这一“纯度导向”的设计思维值得推广——在复杂寡糖、聚合物等结构相似产物体系中，中间体残留对下游成本的影响可能不亚于产量本身。

本文为江南大学刘龙团队在《ACS Synthetic Biology》上发表的DFL无质粒生物合成研究提供了系统的学术解读，旨在为合成生物学、代谢工程与母乳寡糖生物制造领域的研究者、从业者及产业关注者提供参考。