近期，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室王阳副研究员课题组在Biotechnology and Bioengineering期刊发表题为“Uncovering N-Glycosylation-Mediated Allosteric Activation Coupled With Stability Design Enabling High-Yield Human Enterokinase Production”的研究论文。该研究以人肠激酶轻链（human light-chain enteropeptidase，HLEK）为对象，解析N-糖基化修饰对其催化活性的调控机制，并将糖基化介导的变构机制与蛋白稳定性设计相结合，实现了HLEK高水平、高活性重组表达。论文第一作者为江南大学2023级硕士研究生向宇龙，通讯作者为王阳副研究员。

肠激酶（enteropeptidase）是一种具有高度序列特异性的丝氨酸蛋白酶，能够特异性识别并切割DDDDK（D4K）多肽序列，在重组蛋白及多肽的加工成熟领域具有重要应用价值。研究团队首先针对HLEK的4个潜在N-糖基化位点开展定点去糖基化研究。结果发现，远离催化中心的Asn103和Asn165位点的N-糖基化修饰显著增强HLEK的催化活性，其主要作用体现在催化常数（k_cat）的提升。进一步结合分子动力学模拟和蛋白残基动态网络（Protein Residue Dynamical Network，PRDN）分析发现，N-糖基化修饰能重塑蛋白内部残基相互作用网络，缩短信号在残基网络中的传递路径，从而增强糖基化修饰位点与催化中心之间的动态通讯，为N-糖基化修饰促进HLEK催化效率提供了机制解释。

在明确N-糖基化修饰会调控HLEK催化活性的基础上，研究团队进一步针对HLEK表达水平较低的问题，采用^ΔΔG指导的稳定性设计策略开展蛋白工程改造，获得了无N-糖基化修饰的高表达突变体P6。稳定性设计显著提高了HLEK的表达水平，但由于缺失了糖基化修饰，对催化相关的动态网络产生了不利影响，导致催化活性下降。针对这一问题，研究团队将N-糖基化变构机制引入稳定性设计体系，在P6基础上重新引入Asn103和Asn165两个关键糖基化修饰，构建P6_Q103N/Q165N突变体。结果表明，恢复这两个位点的N-糖基化修饰能重新激活相关变构通讯，在保持较高表达水平的同时显著提高催化活性，其比酶活达到P6的约2.7倍。PRDN分析进一步证实，糖基化修饰恢复后，相关残基与催化中心之间的信号传递路径得到优化，从而恢复了与催化过程相关的动态通讯。在5 L发酵罐补料分批发酵中，P6_Q103N/Q165N突变体实现总酶活5.86 × 10⁶ ± 2.52 × 10⁵ U/L，产量达到358 mg/L，约为此前报道最高产量的4倍。该研究为理解蛋白糖基化介导的远程变构调控机制，以及高产、高活性重组蛋白的理性设计提供了新的思路。

上述研究由国家重点研发计划项目（2024YFF1106800）和国家自然科学基金项目（32370079）资助。

图1 HLEK的重组表达及N-糖基化修饰鉴定

图2 HLEK单点去糖基化修饰突变体的表达与酶活性分析

图3 HLEK组合去糖基化修饰突变体的表达与酶活性分析

图4 糖基化与去糖基化状态下相关修饰位点至催化中心信号传递路径的对比

图5 基于^ΔΔG指导的稳定性设计的HLEK突变体及其表达与酶活性分析

图6 整合稳定性设计与N-糖基化变构机制获得高表达高活性的HLEK突变体

图7 最优突变体P6_Q103N/Q165N在5 L补料分批发酵中的总酶活与产量