一、中文标题

基于“设计-构建-测试-学习”框架重塑磷酸酶底物偏好性以调控生物合成（Reshaping Phosphatase Substrate Preference for Controlled Biosynthesis Using a “Design–Build–Test–Learn” Framework）

二、发表单位及通讯作者

·         发表单位：江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室、未来食品科学中心；山东润德生物科技有限公司

·         通讯作者：刘龙（Long Liu），邮箱：longliu@jiangnan.edu.cn

三、科学问题

       如何通过理性设计改造磷酸酶BT4131的底物偏好性，使其优先催化N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸（GlcNAc6P）而非葡萄糖-6-磷酸（Glc6P），从而提升GlcNAc在微生物细胞工厂中的合成效率？

链接：

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.202309852

五、摘要

      本研究提出一种结合量子力学（QM）的计算设计-构建-测试-学习（DBTL）框架，用于理性设计磷酸酶BT4131的底物偏好性。首先通过分子对接与动力学模拟筛选出关键突变位点L129Q（突变体M1），使其对GlcNAc6P的催化效率提升1.4倍。QM计算揭示该偏好性转变源于反应能垒降低13.59 kcal·mol⁻¹。进一步以稳定过渡态为目标进行迭代设计，获得三重突变体M4（I49Q/L129Q/C172L），其对GlcNAc6P的催化效率提升9.5倍，对Glc6P的催化效率降低59%。将M4导入GlcNAc生产菌株，结合GlcNAc6P响应型动态调控系统，在50-L发酵罐中GlcNAc产量达217.3 g·L⁻¹，转化率为0.597 g·g⁻¹葡萄糖，均为目前报道最高水平。该DBTL框架为工业生物催化剂的理性设计提供了高效范式。

图1设计流程

六、研究背景

       酶是微生物细胞工厂实现生物转化的核心元件。然而，天然酶往往催化性能有限，难以满足工业化生产对效率、选择性及稳定性的要求。传统的定向进化通过构建大规模突变库进行筛选，虽取得显著成果，但过程耗时费力且缺乏针对性。半理性设计基于蛋白结构信息缩小突变范围，提高了筛选效率，但对多点突变的组合效应预测仍不准确，难以实现精准的底物偏好性调控。

       近年来，计算酶设计的兴起为理性改造酶提供了新途径。其中，量子力学计算能够从电子层面解析酶催化机制，揭示过渡态结构与能量变化，为设计高活性突变体提供理论指导。然而，如何将QM计算系统性地整合进蛋白质工程流程，形成可迭代的理性设计闭环，仍是领域内的重要挑战。

        磷酸酶BT4131来源于Bacteroides thetaiotaomicron，在GlcNAc合成途径中负责催化GlcNAc6P去磷酸化生成GlcNAc。但其同时对Glc6P具有更高活性，导致碳流损失和副产物积累，严重影响GlcNAc合成效率。因此，精准改造BT4131的底物偏好性，使其“专一”催化GlcNAc6P，是构建高效GlcNAc细胞工厂的关键。

        本研究旨在建立一种融合力场方法与QM计算的DBTL框架，通过理性设计精确调控BT4131的底物偏好性，提升GlcNAc生物合成效率，并为工业酶的理性设计提供可推广的方法论。

七、研究结果

结果1、基于力场方法的底物结合口袋初步设计与验证

       对BT4131晶体结构分析发现其底物结合口袋主要由疏水残基构成。分子对接与动力学模拟表明，空间位阻并非影响底物选择性的关键因素，而口袋内极性分布可能起主导作用。通过虚拟突变扫描结合结合能变化（ΔAffinity）预测，发现L129Q突变能显著增强与GlcNAc6P的亲和力，同时减弱与Glc6P的结合。动力学模拟进一步显示，L129Q突变后Glc6P与关键催化残基D10的距离变得不稳定，而GlcNAc6P则能维持更稳定的反应构象。实验构建单点突变体M1（L129Q），而对Glc6P和果糖-6-磷酸（Fru6P）的催化效率分别降低63.5%和73.1%，初步实现了底物偏好性的定向转变。

图2 分子对接结果

结果2、通过远程突变探索变构调控效应

       为继续提升M1对GlcNAc6P的偏好性，对底物口袋上游残基进行第二轮虚拟扫描。发现位于第172位的半胱氨酸突变可进一步影响底物结合。实验构建双突变体M2（L129Q/C172L），其对GlcNAc6P的催化效率提升至WT的4.1倍，但意外的是对Glc6P的活性也同步升高，表明远距离突变可能通过变构效应影响催化中心，凸显了仅靠结合能预测设计多突变组合的复杂性。

图3 MD模拟和虚拟突变

结果3、基于QM计算揭示底物偏好性转变的能垒机制

        为深入理解催化效率变化的本质，对WT和M1与两种底物的复合物进行QM计算与势能面扫描。结果表明，M1与GlcNAc6P反应的过渡态能垒较WT降低了13.59 kcal·mol⁻¹，而与Glc6P反应的能垒则升高了8.04 kcal·mol⁻¹。这主要归因于：1）突变后GlcNAc6P在反应物构象中更靠近亲核试剂D8；2）在过渡态中，Q129与D180、W174形成“极性三角”氢键网络，稳定了GlcNAc6P的过渡态构象。相反，Glc6P在突变后难以形成稳定的反应构象，导致反应能垒升高。QM计算从能量层面揭示了底物偏好性转变的结构动力学根源。

结果4、聚焦过渡态稳定的迭代理性设计

        基于QM揭示的机制，新一轮设计以稳定GlcNAc6P过渡态构象为核心目标。对靠近乙酰基的疏水残基I49进行虚拟突变扫描，预测其突变为谷氨酰胺（I49Q）能选择性稳定GlcNAc6P的过渡态。实验构建双突变体M3（I49Q/L129Q），其对GlcNAc6P的催化效率提升至WT的4.6倍，同时对Glc6P的活性被显著抑制。最终，结合前期有效突变，构建三重突变体M4（I49Q/L129Q/C172L），较WT提升9.5倍，而对Glc6P的催化效率降低59%，实现了底物偏好性的精准重塑。整个设计过程仅构建了不到10个突变体，极大提升了设计效率。

图4 机制解析

结果5、工程化磷酸酶在GlcNAc生物合成中的应用与验证

        将优选突变体导入GlcNAc生产菌株，并配以基于转录因子nagC的GlcNAc6P响应型动态调控系统，实现磷酸酶表达的自我反馈调节。在50-L发酵罐中，表达M4的菌株GlcNAc产量达217.3 g·L⁻¹，转化率为0.597 g·g⁻¹葡萄糖，较对照菌株提升25.8%，且细胞生长迟滞现象缓解。动力学模型模拟进一步证实，磷酸酶对GlcNAc6P的高选择性是高效合成的关键。胞内代谢物检测显示，M4的引入显著降低了胞内GlcNAc6P积累，减轻了磷酸糖压力，从而提升了葡萄糖摄取和整体代谢通量。

图5 动态调控系统应用

八、讨论

        本研究成功构建了一个融合经典力场方法与量子力学计算的迭代DBTL框架，实现了对磷酸酶底物偏好性的精准、高效理性设计。该框架的先进性在于：1）通过QM计算直接从能量层面解析催化机制，指导以稳定过渡态为目标的迭代设计；2）将“学习”环节深度融入设计循环，使每次迭代都基于对前一轮结果的机理解析，显著提升了设计针对性和成功率；3）仅通过少量突变体测试即获得高性能催化剂，克服了传统方法依赖大规模库构建与筛选的瓶颈。该工作不仅为GlcNAc的高效生物制造提供了关键酶元件，也为工业酶的理性设计提供了一个可借鉴的强大范式，有望推广至其他需要精准调控底物特异性的生物催化过程。