二岩藻糖基乳糖（DFL）作为人乳寡糖（HMOs）中的重要组分，具有显著的抗菌和免疫调节功能。然而，受限于关键酶α-1,3-岩藻糖基转移酶（α-1,3-FucT）的催化效率及发酵工艺，其工业化生产成本居高不下。近日，江南大学团队在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 发表最新研究，通过挖掘来源于封丘芽孢杆菌（Bacillus fengqiuensis）的新型α-1,3-FucT，并结合半理性设计与高通量筛选，构建了高效工程菌株。在3-L补料分批发酵中，DFL产量达到65.12 g/L，为目前报道的最高水平。

在HMOs的生物合成中，糖基转移酶是核心“芯片”。传统的α-1,3-FucT多来源于幽门螺杆菌（H. pylori），存在表达量低、包涵体多、活性不理想等问题。如何获得具有工业级应用潜力的新型酶元件，是提升DFL产量的关键。

1. 从头合成路径的构建与模块优化 (Figure 1 & 2)

研究团队首先在 E. coli BL21(DE3) 底盘中构建了以甘油为碳源的DFL从头合成途径。路径设计（Fig. 1）：引入GDP-L-岩藻糖合成途径（manC, manB, gmd, wcaG）以及双酶级联（α-1,2-FucT 和 α-1,3-FucT），将乳糖转化为DFL。

模块平衡（Fig. 2）：为了解决多基因表达的代谢负担，作者通过组合不同拷贝数的质粒（pRSF, pCDF, pET），精细调节了代谢流。结果显示，BZ05菌株组合表现最佳，证明了基因表达水平的平衡对产物积累至关重要。

2. 新型酶元件的挖掘：锁定封丘芽孢杆菌 (Figure 3)

这是本研究的第一大亮点。系统发育分析（Fig. 3C）：摒弃了常用的H. pylori 来源，团队基于序列同源性筛选了4个潜在的α-1,3-FucT。实测验证（Fig. 3B）：来源于Bacillus fengqiuensis的 BfFucT表现出卓越的性能，相比于经典的Fut3Bc，其构建的菌株DFL产量更高。芽孢杆菌来源的酶通常具有更好的溶解性和稳定性，更适合工业发酵环境。

3. 半理性设计与“热点”突变 (Figure 4)

为了进一步提升BfFucT的催化效率，团队采用了“半理性设计”策略。策略一：序列比对（Fig. 4A）：参考已知高活性的M32和MH5突变体，定位了5个关键位点。策略二：HotSpot Wizard 3预测：针对催化中心附近的残基进行饱和突变预测。结果（Fig. 4D/E）：筛选得到单点突变体N25K和N276D显著提升了产量。随后，通过叠加有益突变，获得了五点组合突变体 MM5 (F22Y/N25K/T98K/E99Q/N276D)，其DFL产量较野生型大幅提升。

4. 突破筛选瓶颈：建立DNS高通量筛选平台 (Figure 5)

这是本研究的方法学创新。痛点：糖基转移酶反应不产生荧光信号，传统HPLC检测通量太低。原理（Fig. 5A）：巧妙利用DNS法（3,5-二硝基水杨酸法）检测还原糖的变化。由于底物乳糖和产物DFL均为还原糖，但反应过程中涉及糖基供体的转移和副产物生成，通过优化反应体系，建立了吸光值与产物生成的关联。应用：这一HTS平台成功从数千个突变体中筛选出了高产菌株，极大地缩短了研发周期。

5. 分子动力学模拟揭示机制 (Figure 6)

RMSF分析（Fig.6B）：突变体MM5在关键区域的均方根涨落（RMSF）显著低于野生型（WT）。这表明突变引入的氢键网络和静电相互作用（如F22Y引入的氢键，N25K/T98K引入的正电荷）增强了蛋白结构的刚性和稳定性。结构洞察：更稳定的结构有利于维持活性中心的构象，从而提高催化效率。

6. 工业化潜力验证：65.12 g/L 的里程碑 (Figure 7)

放大发酵：在3-L发酵罐中，使用MM5突变体的工程菌BZL01-26进行了补料分批发酵。数据：78小时发酵结束时，DFL滴度达到 65.12 g/L，生产强度为0.83 g/(L·h)。意义：这一数据刷新了目前公开报道的DFL发酵最高纪录，且底物甘油转化率良好，展示了极强的工业应用前景。