大肠杆菌K4无抗生素表达系统的构建与果糖软骨素合成途径优化

作者：

孙婕妤^1,2,3, 朱雨豪², 石智诚^1,2, 肖森^1,2,3, 黄子洋³, 徐志兵³, 堵国成^2,4, 陈坚^2,3,4, 康振^1,2,3*

单位：

1.   江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室

2.   江南大学 未来食品科学中心

3.   江苏省产业技术研究院食品生物技术研究所

4.   江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室

基金项目：

国家自然科学基金项目(32400056);江苏省合成生物基础研究中心资助(BK20233003);无锡市产业创新研究院先导技术预研项目(XD24006)

摘要及关键词

摘要：果糖软骨素是酶法合成硫酸软骨素的关键前体物质。目前果糖软骨素的生物合成面临诸多挑战,包括合成效率低、提取工艺复杂以及生产过程中对抗生素的依赖等问题,严重限制了其规模化生产和应用。为了解决上述问题,该研究以可天然合成与转运果糖软骨素的大肠杆菌K4作为底盘细胞,构建了一个无抗性基因质粒表达载体pMUT2 ΔHyp3,该质粒在无抗生素压力下可维持9 d的遗传稳定性。通过重组过表达谷氨酸棒状杆菌来源的尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖脱氢酶编码基因ugdA2与枯草芽孢杆菌来源的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶编码基因glmU强化前体合成,果糖软骨素摇瓶产量提升至0.95 g/L。进一步优化发酵培养基组分,产量达到1.35 g/L。最终在3 L发酵罐中无抗生素发酵,48 h产量可达到7.5 g/L,收率达4.4%(质量分数)。该研究不仅实现了果糖软骨素的合成,解决了重组大肠杆菌K4发酵抗生素依赖的问题,也为硫酸软骨素的绿色酶法制造提供了规模化生产的基础。

关键词：无抗生素表达系统；果糖软骨素；硫酸软骨素；多糖；大肠杆菌K4

主要结论

质粒稳定性测试表明，pMUT2在大肠杆菌K4中具有较好的无抗生素遗传稳定性（可维持至第7天），而pMUT1在第2天即快速丢失。对pMUT2进行元件敲除后发现，其稳定性依赖于RelE-RelB毒素-抗毒素系统，敲除RelE后质粒迅速丢失；而敲除Hyp3反而使稳定性延长至第9天。因此，选取稳定性最优的pMUT2 ΔHyp3为载体，并通过FRT/FLP系统删除其抗性基因，最终构建出无抗性标记的质粒表达载体。

为增强前体UDP-GlcA的合成通量，本研究在pMUT2 ΔHyp3载体中分别表达了来自谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，兽疫链球菌，恶臭假单胞菌和大肠杆菌等5种不同来源的galU基因。结果显示，在无抗生素条件下，过表达兽疫链球菌来源的galU1效果最优，使果糖软骨素产量达到0.31 g/L，较野生型大肠杆菌K4提高210%（图4-b）。进一步对不同来源的ugd基因进行表达验证，发现过表达谷氨酸棒杆菌来源的ugdA2能最显著提升产量，达0.57 g/L，较野生型提高470%（图4-c）。

为合成果糖软骨素的前体UDP-GalNAc，本研究重点考察了涉及该途径的三个关键酶：氨基转移酶（GlmS）、磷酸葡萄糖胺变位酶（GlmM）和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（GlmU）。通过将来源于大肠杆菌MG1655，枯草芽孢杆菌，恶臭假单胞菌，兽疫链球菌和谷氨酸棒杆菌5种微生物的相应基因构建至载体pMUT2 ΔHyp3并进行表达比较，发现枯草芽孢杆菌来源的glmS1、大肠杆菌来源的glmM以及枯草芽孢杆菌来源的glmU表达效果最佳，其对应的果糖软骨素产量分别达到0.21、0.20和0.54 g/L，较野生型大肠杆菌K4分别提高了110%、100%和440%。结果表明，GlmU催化的步骤是UDP-GalNAc合成途径中的关键限速步骤，其中过表达枯草芽孢杆菌来源的glmU对产量提升最为显著。

在分别优化UDP-GlcA与UDP-GalNAc合成途径的基础上，进一步对两条途径进行组合表达研究。我们在表达谷氨酸棒杆菌来源ugdA2的基础上，分别串联表达了兽疫链球菌galU1、枯草芽孢杆菌glmS1、大肠杆菌glmM和枯草芽孢杆菌glmU，构建了菌株K4-CH-1至K4-CH-4。发酵结果显示（图6-a），仅强化UDP-GlcA合成的K4-CH-1产量下降约50%（0.05 g/L），推测是因前体供给失衡所致。而同时强化另一前体UDP-GalNAc合成的菌株产量显著提升：K4-CH-2、K4-CH-3和K4-CH-4分别达0.29、0.66和0.95 g/L，较野生型提高190%、560%和850%。其中，共表达ugdA2与glmU的K4-CH-4效果最优，说明在平衡且充足的前体供应下，果糖软骨素合成能力达到最高。

为进一步提升果糖软骨素产量，本研究对发酵培养基进行了优化。初步选用LB营养肉汤、M9基本培养基和甘油培养基进行测试，结果均不理想，产量显著低于原有培养基。因此，我们在原培养基基础上重点优化碳氮源组合，发现同时添加6 g/L酵母提取物和4 g/L胰蛋白胨时效果最优，摇瓶产量提高至1.35 g/L（图6-b）。随后采用该优化培养基，在3 L发酵罐中进行分批补料发酵（图6-c），最终果糖软骨素产量达到7.5 g/L，收率为4.4%（质量分数）。

本研究构建了一套无抗生素表达系统并实现了果糖软骨素的合成，降低了生产中对抗生素的依赖，为绿色酶法合成CS奠定了良好基础，后续可进一步对果糖软骨素产量优化提升，并敲除大肠杆菌K4中的果糖基转移酶（KfoE），直接合成软骨素，从而降低工业生产的成本。

近年来康振教授团队在基因表达调控体系构建以及糖胺聚糖细胞工厂设计构建优化以及产业化方面取得丰硕成果，相关研究成果已发表在Nature Communication (2025, 2023, 2020)、ACS Catalysis (2021)、Nucleic acids Research (2025)、Chemical Engineering Journal (2025)、Carbohydrate Polymers (2024, 2024, 2022, 2022, 2020, 2020)、Green Chemistry (2022、2021)等本领域权威期刊。