标题：Enhancing the Catalytic Efficiency of L-Rhammose Isomerase for D-Allose Synthesis through Simultaneous Engineering of Noncatalytic and Catalytic Pockets
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry

一、研究背景与意义

D-阿洛糖（D-allose）是一种自然界中含量极低的稀有糖，其甜度约为蔗糖的80%，具有超低热量、无毒等特点，并展现出抗癌、抗炎、抗氧化等多种生理功能，在食品、医药和保健品领域具有重要应用价值。

目前，D-阿洛糖的主要生产方法是通过L-鼠李糖异构酶（L-RI） 催化D-阿洛酮糖（D-allulose）异构化而来。然而，现有L-RI对D-阿洛酮糖的催化效率较低，限制了其工业化应用。因此，通过蛋白质工程手段提升L-RI的催化效率具有重要意义。

二、研究策略与方法

本研究采用半理性设计+高通量筛选的策略，对来源于Clostridium stercorarium的L-RI进行定向进化，主要从两个维度进行酶改造：

🔍 1. 结构建模与分子动力学模拟

图1 | L-RI的结构建模。 (A) 使用SWISS-MODEL构建的催化口袋“盖子”开放构象模型。(B) 使用AlphaFold构建的“盖子”闭合构象模型。

·      使用SWISS-MODEL和AlphaFold构建L-RI的开放与闭合构象模型。

·      通过分子动力学模拟揭示“盖子”（lid）结构的动态行为，确认其在底物结合与催化中的关键作用。

🧪 2. 非催化口袋工程

图2 | L-RI的非催化口袋与催化口袋。图中红色部分为“盖子”（β1-α1 loop），绿色为催化口袋，蓝色区域为通过分子对接识别出的三个可能结合底物的非催化口袋。

·      通过分子对接识别出3个可能结合D-阿洛酮糖的非催化口袋。

·      突变关键氨基酸（如E53D、A142G、E273D等），减少底物在这些口袋的停留，提高其进入催化口袋的概率。

⚙️ 3. 催化口袋工程

图3 | 基于吡喃糖氧化酶-过氧化物酶的高通量筛选流程。该体系通过将产物D-阿洛糖转化为蓝色物质，实现突变体催化活性的快速检测与筛选。

·      针对催化口袋周围的氨基酸进行突变，特别是H99A，显著降低了空间位阻，提高了催化效率。

·      建立基于吡喃糖2-氧化酶和过氧化物酶的高通量筛选体系，快速筛选高效突变体。

🧫 4. 全细胞催化系统构建

·      将优选突变体在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 中表达，构建全细胞催化剂，简化工艺并降低成本。

三、主要研究结果

✅ 1. 突变体催化效率显著提升

图4 | 多重位点组合突变体的活性测定。组合突变体E53D/A142G/E273D/H99A的催化活性相比野生型提高了170%。

·      组合突变体 E53D/A142G/E273D/H99A 对D-阿洛酮糖的催化效率（(k_{cat}/K_m)）相比野生型提高了 **170%**。

·      (k_{cat}) 值提升至野生型的2.5倍，表明突变体催化速率大幅提升。

✅ 2. 结构机制解析

图5 | H99位点的空间位阻效应分析。野生型H99（组氨酸）的大侧链（五元环）对“盖子”运动和底物通道造成空间阻碍；突变体H99A（丙氨酸）消除了该位阻，从而提升了催化效率。

·      H99A突变显著减少了催化口袋周围的立体阻碍，有利于底物进入和产物释放。

·      分子动力学模拟显示，突变后催化口袋上方的环区（loop）波动减小，结构更稳定。

✅ 3. 全细胞催化性能优异

图6 | 全细胞催化反应条件优化。考察了温度(A)、pH(B)、金属离子(C)及Mn⟡⁺浓度(D)对枯草芽孢杆菌全细胞合成D-阿洛糖的影响，确定了最佳反应条件。

·      在最优条件下（75°C，pH 8.0，2 mM Mn⟡⁺，60 g/L湿细胞），使用表达突变体的枯草芽孢杆菌全细胞进行催化。

·      在90分钟内，从100 g/L D-阿洛酮糖转化得到 36.5% 的D-阿洛糖，转化率显著高于野生型。

四、创新点与意义

🚀 1. 双重口袋工程策略

传统酶工程多集中于催化活性中心，本研究创新性地将非催化口袋纳入工程范围，通过调节底物通道和局部浓度，间接提升催化效率。

🧠 2. 结构动态视角

通过分子动力学模拟揭示“盖子”结构的开放与闭合机制，为理解L-RI的底物识别与催化过程提供了新视角。

🏭 3. 工业化应用潜力

构建的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂具备高效、稳定、易规模化等优势，为D-阿洛糖的工业化生产提供了有前景的生物催化剂。

五、总结与展望

本研究通过非催化口袋与催化口袋的同步工程，成功提升了L-RI对D-阿洛酮糖的催化效率，并结合全细胞催化系统实现了高效的D-阿洛糖合成。该策略不仅为L-RI的理性设计提供了新思路，也为其他酶的功能改造与工业应用提供了借鉴。

未来可进一步探索：

·      更多非催化区域的工程潜力

·      酶的热稳定性与操作稳定性提升

·      在连续流反应器中的应用优化