近期，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室饶义剑教授团队在“设计人工简短的生物催化级联反应用于合成莱鲍迪苷M”方面取得重要进展，研究成果“Designing an artificially concise biocatalytic cascade for the manufacture of rebaudioside M from a naturally derived steviol glycoside mixture”正式发表于Green Chemistry （IF=9.2）。

莱鲍迪苷M（Reb M）是一种具有高甜度、低热量、口感优良的天然甜味剂。然而，其在甜菊叶中的含量极低，传统提取工艺成本高且不可持续，严重制约了工业化应用。酶法合成为Reb M生产提供了绿色可持续的替代途径，但受限于糖基转移酶（UGT）的底物特异性，现有方法通常依赖高纯度的单一底物，导致能耗高、废弃物多，且对天然混合物的利用效率低。为了克服这些限制，江南大学饶义剑教授课题组设计并构建了一条简洁高效的双酶级联生物催化体系，通过利用酶的底物混杂性，酶筛选和理性改造，实现了从天然甜菊糖苷混合物中高效生物合成Reb M（Fig. 1）。在解决了包括酶的底物混杂性、限速步骤和模块间平衡在内的关键挑战后，优化的酶级联系统实现了Reb M的高效生物合成，最终产量达到38.8 g/L，摩尔产率为85.5%。这一研究不仅为Reb M提供了绿色、可扩展的生物制造新途径，也为从复杂植物提取物中可持续生产高价值天然产物提供了参考范例。

Fig. 1 Design of an artificially concise and green enzyme cascade for the biosynthesis of Reb M from a naturally ST/Reb A mixture

首先，基于逆合成途径分析和糖基转移酶催化机制，研究团队设计了一条以天然混合底物甜菊苷（ST）和莱鲍迪苷A（Reb A）为原料的两步生物合成路线（Fig. 1）。该路线的关键在于鉴定一种能够催化ST和Reb A分别转化为其相应中间体Reb D和Reb E的酶（模块I）。然后，Reb D和Reb E在另一种酶的催化下同时生成单一产物Reb M（模块 II）。为了构建所提出的生物合成途径，研究团队通过公开数据库（https://pugtdb.biodesign.ac.cn/ 和 UniProt）筛选候选UGT酶，并结合催化特性、系统发育分析、底物相似性比较和活性位点口袋分析，确定了20个具有潜力的候选酶。活性测定结果显示，UGT94B1对ST和Reb A均具有糖基化活性，生成产物Reb E与Reb D经¹H NMR与LC-MS表征得到验证。随后，UGT76G1-M3被证实可高效催化Reb E和Reb D生成Reb M。最终，实现了以ST与Reb A混合底物到Reb M的同步转化，凸显了其在简化和可扩展生物生产方面的潜力（Fig. 2）。

Fig. 2 Establishment of two-enzyme cascade reaction to efficiently synthesize Reb M from a naturally Reb A/ST mixture in vitro

尽管UGT94B1被证实能够催化ST和Reb A糖基化分别生成Reb E和Reb D，但其催化效率较低，限制了该合成途径的整体性能。为了克服这一限制，团队应用了基于结构的理性设计策略增强了限速酶UGT94B1的催化性能，获得高效突变体UGT94B1-I146G/P174V，其对ST和Reb A的活性分别提高了3.68倍和3.3倍，并显著提高了中间体糖苷Reb E和Reb D的产率（Fig. 3）。

Fig. 3 Rational design of key enzyme UGT94B1 to improve its catalytic activity and promiscuity towards mixed substrates ST/Reb A

同时，通过分子动力学模拟和动力学分析阐明了UGT94B1-I146G/P174V突变体催化性能提升的机制（Fig. 4）。在突变体UGT94B1-I146G/P174V中，催化残基H20的ε-氮与ST或Reb A的C-19羧基相连的葡萄糖部分的2-OH基团上的氢原子之间的距离分别从4.97 Å和4.09 Å缩短到3.47 Å和3.08 Å，且底物ST或Reb A的C-19羧基相连的葡萄糖部分的2-OH基团的氧原子与UDPG的C1碳原子之间的距离也分别从4.51 Å和3.68 Å缩短至3.63 Å和3.60 Å，这些距离的缩短可能促进了更有利于催化的构象，从而增强了突变体的活性。此外，UGT94B1-I146G/P174V突变体对底物ST和Reb A的k_cat值较野生型酶UGT94B1分别提高了2.2倍和2.6倍。相应地，对ST和Reb A的k_cat/K_m值分别达到370.9和387.3 mM^⁻¹·min^⁻¹，分别是野生型酶（UGT94B1：对ST和Reb A的k_cat/K_m值分别为105.7和128.7 mM^⁻¹·min^⁻¹）的3.5倍和3.0倍。

Fig. 4 Investigating the mechanism for improving catalytic activity of UGT94B1

为降低昂贵糖基供体UDP-葡萄糖（UDPG）的消耗，团队将拟南芥来源蔗糖合成酶（AtSuSy）与UGT94B1-I146G/P174V和UGT76G1-M3共表达，构建了一个能够在原位再生UDPG的级联酶系统。通过对模块I的酶级联反应条件（温度，pH，UDP和蔗糖浓度）进行了优化，并适配优化模块I和模块II的酶比例，发现当菌株UGT76G1-M3-AtSuSy与菌株UGT94B1-I146G/P174V-AtSuSy细胞裂解液浓度的比例为1:2时，在最优酶级联催化条件下，以混合底物ST/Reb A合成Reb M的产率最高，达到83.0%（Fig. 5）。

Fig. 5 Optimizing the enzyme cascade reaction process for improving the biosynthesis of Reb M

最后，在10 mL体系内，以模块 I（UGT94B1-I146G/P174V-AtSuSy）与模块 II（UGT76G1-M3-AtSuSy）的最佳比例（2:1）进行Reb M 的大规模合成。结果表明，催化12 h后，Reb M的浓度达到38.8 g/L，底物ST/Reb A转化为Reb M的总摩尔转化率达85.5%（Fig. 6）。这些结果表明该酶级联系统具有利用廉价的ST/Reb A混合物底物绿色高效地进行Reb M工业规模生物合成的巨大潜力。

Fig. 6 Scale-up of Reb M production via a one-pot two-step reaction from natural ST/Reb A mixtures

重点实验室罗正山副研究员和23级硕士生郭旭鹏为共同第一作者，饶义剑教授为通讯作者。上述工作得到了江苏省自然科学基金（BK20202002和BK20200692）、国家自然科学基金（22108122）、江苏省基础研究计划和江苏省合成生物学基础研究中心（BK20233003）、中央高校基本科研业务费专项资金（JUSRP202404012、JUSRP124020）资助。

近年来饶义剑教授团队围绕“天然产物的途径解析和仿生定向合成与应用”开展了系统性的研究，并取得了一系列原创性研究成果，部分成果已发表在Nature Commun (2023，2024，2025)、JACS (2024，2025)、Angew (2022，2023，2024)、Advanced Science (2025)、ACS Catal (2020，2021，2022，2024，2025)、Green Chemistry (2019, 2022, 2025)等本领域权威期刊。