近日，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室康振教授课题组在肝素2‑O‑磺基转移酶高效表达与定向改造取得重要进展。研究成果以“Efficient expression of an engineered heparan sulfate 2‑O‑sulfotransferase with improved catalytic properties”为题发表在学术期刊《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上（DOI：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.5c00771）。江南大学2022级硕士生陈吴霞为论文第一作者，康振教授和博士后胥睿睿为论文通讯作者。

肝素是一种高度磺酸化的多糖，在多种生理和病理生理功能中发挥着重要作用。肝素2‑O‑磺基转移酶(2-OST)是肝素生物合成过程中第二步磺酸化修饰的关键酶，利用磺酸基供体3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPS）将磺酸基团转移至己糖醛酸残基的C2位点，从而生成2-O-磺酸化的IdoA2S或GlcA2S。然而，表达量与酶活性低等问题限制了其应用。为此，团队采用多种策略来提高表达水平、催化性能及稳定性。首先，基于多策略协同的2-OST的N端工程化改造以实现其高效表达。通过筛选促溶标签，确定SUMO标签为最优选择，并结合刚性连接肽PAPAP，使2-OST酶活性提升至387.40 U/mL。随后，进一步采用N端同义密码子优化策略，利用FACS技术筛选出高表达突变体菌株。经验证，NCS-14菌株的表达水平显著提高，较野生型提高1.48倍，其酶活达到了606.79 U/mL，是原始活性的1.78倍。

随后，采用半理性设计策略，对SUMO-Ga2OST的稳定性与催化性能进行改造。借助HotSpot Wizard、FireProt等计算工具并结合深度进化分析锁定了21个关键氨基酸位点。对比评估野生型与突变体的表达及催化性能发现，双点突变体SUMO-Ga2OST A98K/Y145F比酶活提升2.32倍，催化效率（k_cat/K_m）提高1.89倍，稳定性增强7.8倍。SAX-HPLC分析表明，其对CDSNS肝素底物的转化率高达72.43%，转化效率提升1.48倍。三维结构与分子动力学分析证实，两处突变显著增强了蛋白质稳定性。最后，对突变体进行5 L罐分批补料发酵，诱导21 h后OD₆₀₀为52.00，酶活达峰值5720 U/mL，蛋白产量达37.23 mg/g DCW。

以上研究为未来在肝素生产和其他磺基转移酶改造工艺中的生物工程应用提供了坚实的基础。相关策略也可以扩展到优化糖胺聚糖相关酶，推进临床多糖生产。本工作得到国家重点研发计划项目(2024YFF1106300)、国家自然科学基金项目(U24A20368, 32370066)、江苏省合成生物学基础研究中心（BK20233003）的资助。

图1 2OST在大肠杆菌中的活性表达

图2 N端同义密码子优化增强SUMO-Ga2OST的表达

图3 SUMO-Ga2OST的进化诱导突变

图4 SUMO-Ga2OST催化性能及稳定性的优化

图5 SUMO-Ga2OST及其突变体的结构和动力学分析

图6 SUMO-Ga2OST A98K/Y145F发酵工艺优化