近日，Chemical Engineering Journal在线发表了江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室康振教授课题组的研究成果“Engineering Komagataella phaffii cell factories for the production of chondroitin sulfate A with high sulfation degree” (DOI: 10.1016/j.cej.2025.165780)。江南大学2022级博士生熊海波为论文第一作者，李江华教授、康振教授和博士后胥睿睿为论文通讯作者。

硫酸软骨素（CS）是一种硫酸化糖胺聚糖，被誉为“关节软黄金”、广泛用于维持骨关节和软骨健康，并具有抗癌、抗凝血、抗糖尿病和抗肥胖特性的应用潜力。商业化CS主要从陆生动物（如禽类、牛、猪）和海洋生物（如鲨鱼）的软骨组织中提取，但原料的异质性、可变性、供应不可靠以及人畜共患病的高风险阻碍了需求满足。随着合成生物学的快速发展，微生物合成已成为大规模生产硫酸软骨素A（CSA）的一种有前景的替代方法，但此前的研究常受限于产量低或磺酸化程度不足，难以满足实际应用需求。

针对上述瓶颈，课题组系统性构建毕赤酵母细胞工厂，用于高效合成高磺酸化CSA（图1）。通过分步优化实现了CSA磺酸化程度的逐级提升：首先通过重建软骨素合成通路、表达C4ST酶并通过补充足量硫酸盐、增强硫酸盐转运，实现了82.3 mg/L CSA，磺酸化度为18.6%的合成（图2）；随后探究软骨素合成与磺酸化的动态关系并多拷贝整合C4ST基因（>9拷贝），使磺酸化度提升至57.7%（图3）。在此基础上，构建并优化了PAPS再生系统，依次引入ATPS、APSK、PPK和PAPD等关键酶，分阶段将磺酸化度进一步提高至90.3%。结合启动子工程协调PAPS供应与磺酸化模块，最终实现了96%磺酸化度的硫酸软骨素的合成（图4），并在5 L发酵罐中采用生长耦联补料及精准控金属离子浓度的策略稳定产出1.15 g/L CSA，分子量为58 kDa（图5）。本研究为高磺酸化CSA的生物制造提供了一种具有吸引力的策略。此外，所建立的工程手段也可推广应用于构建其他毕赤酵母细胞工厂，用于合成如肝素、抗凝血肽等具有应用价值的硫酸基化合物。

上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2024YFF1106300）、国家自然科学基金项目（U24A20368、32370066、32400056）、江苏省自然科学基金（BK20241616）、中国博士后科学基金项目（GZC20240607）、江苏省合成生物学基础研究中心（BK20233003）、中央高校基本科研业务费专项资金（JUSRP622003）项目的资助。

图1 K. phaffii模块化工程改造合成高磺酸化度硫酸软骨素A

图2 硫酸盐充足供应实现软骨素磺酸化

图3 软骨素合成与磺酸化的动态关系的探究

图4 设计PAPS再生系统以提高磺酸化能力

图5 启动子工程平衡多酶表达与发酵优化