近日，Amino Acids在线发表了糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授课题组的研究成果“Semi-rational design of L-amino acid deaminase for production of pyruvate and D-alanine by Escherichia coli  whole-cell biocatalyst” (Liu et al., 2021, Amino Acids, 53(9):1361-1371)。江南大学2018级硕士毕业生刘克为论文第一作者，实验室的吕雪芹副研究员与刘龙教授为论文通讯作者，论文作者还包括刘延峰研究员、李江华教授和堵国成教授。

丙酮酸位于合成代谢与分解代谢的转折点，在生物能量代谢中具有十分重要的作用，同时丙酮酸还是药物合成领域的重要中间体，广泛应用于食品、农药等领域中。目前丙酮酸的生产方法主要有化学合成法、微生物发酵法和酶转化法。其中，化学合成法的生产成本较高，且易对环境造成较大污染；微生物发酵法的产物成分复杂且分离难度大；酶转化法涉及到酶的分离纯化，生产成本亦较高。为了避免上述问题，研究者在前期的工作中，使用质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达源于奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶（Pm1），并全细胞催化D,L-丙氨酸外消旋溶液，实现了一步法生产丙酮酸和D-丙氨酸。然而，由于Pm1的酶活不高，基因工程菌生长缓慢，且质粒表达存在不稳定性等原因，丙酮酸的合成受到了限制。

为了解决上述问题，在此前研究的基础上，本研究首先利用Discovery Studio软件的CDOCKER模块对酶分子PM1以及底物分子L-丙氨酸进行分子对接，选取活性中心的Gln99、Val437、Tyr97、Leu278、Val411与Trp438位点进行定点饱和突变，构建突变文库；之后，为提高筛选效率，建立了基于2,4-二硝基苯肼显色的丙酮酸微孔板高通量筛选方法；使用该方法筛选得到正向突变菌株V437I，其丙酮酸产量提高至18.64 g/L，比酶活提高1.88倍，分析认为突变后437号位点的异亮氨酸与438号位点的色氨酸均与底物L-丙氨酸形成了新的氢键，这可能使酶分子与底物的结合更加稳定，从而提高了Pm1的催化效率；之后，向之前构建的BLK07菌株基因组中引入磷酸酮醇酶（Xpk）并过表达果糖-1,6-二磷酸酶（Fbp），构建非氧化糖酵解途径（NOG），用以绕过被破坏的丙酮酸代谢途径，从而改善了菌体的生长情况；最后，使用CRISPR/Cas9系统将N6-pm1-V437I基因表达框整合至BLK07基因组，摇瓶催化结果显示丙酮酸产量达到42.20 g/L，D-丙氨酸的分辨率为82.4%。研究表明该工程菌株在工业化生产丙酮酸和D-丙氨酸方面具有很大的潜力。

上述研究工作得到了国家重点研发计划项目(2018YFA0900504)、国家自然科学基金项目(31870069, 32021005)、中央高校基本科研专项资金(USRP52019A, JUSRP121010, JUSRP221013) 等项目的资助。

图1 L-丙氨酸与Pm1的结合位点及关键残基的结构特征

图2 最佳显色剂浓度的确定

图3 不同显色剂浓度下丙酮酸浓度与OD₅₂₀的线性关系

图4 Pm1的定点饱和突变及高通量筛选

图5 NOG途径基因的基因组整合

图6 BLK07P1-N6-V437I菌株的构建