近日，ACS Synthetic Biology在线发表了糖化学与生物技术教育部重点实验室刘延峰研究员课题组的研究成果 “Inducible population quality control of engineered Bacillus subtilis for improved N-acetylneuraminic acid biosynthesis” (ACS Synthetic Biology, 2021, 10, 9, 2197–2209, https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.1c00086)。江南大学2020级博士生曹燕亭为论文第一作者，实验室的堵国成教授、刘延峰研究员为论文通讯作者，论文作者还包括吕雪芹副研究员、李江华教授、刘龙教授和陈坚教授。

合成生物学驱动的微生物细胞工厂构建已成为重要营养化学品绿色、可持续制造的重要途径。然而，由于突变导致的遗传异质性、复杂调控的表型异质性，从单菌落培养而来的细胞群体在生长和代谢方面表现出异质性，如生产能力不同的高产、低产和非生产细胞亚群。后两者由于代谢负担轻而更加具有生长优势，在长期或大规模发酵过程中它们更易取代高产细胞亚群，这降低了生产稳定性、限制了生物合成的工业适用性。针对此问题，已有研究在大肠和酵母中利用正向响应产物的生物传感器调控抗生素抗性基因、氨基酸合成途径关键基因和必需基因表达，将产物合成与细胞生长偶联起来，赋予高产（生产）细胞亚群生长优势，提高纯培养物中高产（生产）细胞亚群所占的比例，从而改善了生物合成效率。但是这些方法限定了培养基组成，需要添加抗生素或者目标产物、缺少某种生长所需氨基酸，此外，这些方法以单一表达盒的形式用传感器启动子调控生长关键基因表达，整个系统易因受到突变而失效，因此，其适应性和鲁棒性均受限。

针对此问题，江南大学生物系统与生物加工工程研究室研究人员在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中基于响应N-乙酰神经氨酸（又称燕窝酸）的生物传感器开发了适应性和鲁棒性均提高的诱导型群体质量控制系统（iPopQC)，显著改善了N-乙酰神经氨酸的生物合成。首先，研究人员利用响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器分析了发酵过程中不同细胞亚群所占比例的变化，发现随着发酵时间延长，非生产细胞亚群逐渐取代生产细胞亚群，当发酵72h时，其比例已经达到整个细胞群体的95%（图1）。随后，构建了IPTG诱导的响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器，并用来在转录水平上调控不同的必需基因表达，同时利用不同的RBS和N-端编码序列在翻译水平上优化必需基因表达，成功实现了生长与合成的偶联（图2）。将成功构建的iPopQC引入N-乙酰神经氨酸生产菌株，通过进行动态细胞亚群调控，N-乙酰神经氨酸产量实现了1.97倍增加，达到了3.86g/L（图3）。

为了进一步证明iPopQC是通过富集生产细胞亚群改善生物合成效率的，研究人员分析了有iPopQC和无iPopQC菌株在发酵过程中不同细胞亚群所占比例的变化，发现开启iPopQC后，有iPopQC菌株在发酵过程中一直维持高比例的生产细胞亚群。发酵55h，与无iPopQC菌株相比，无iPopQC菌株的生产细胞亚群比例增加了48.8%。随后，研究人员通过在重发酵经iPopQC富集的培养物，发现培养物在开启iPopQC时产量可以达到3.9g/L，而在不开启iPopQC时产量只有1.92g/L，因此，研究人员推测N-乙酰神经氨酸发酵过程中的异质性是表型异质性，而非突变导致的遗传异质性。接下来，研究人员用基因组重测序也证实了这一结果。

为了改善iPopQC的鲁棒性，研究人员以两个表达盒的形式用传感器启动子同时调控两个必需基因的表达，构建了更稳定的双输出iPopQC。通过连续传代模拟工业规模发酵分析了单输出iPopQC（前面的iPopQC均为单输出iPopQC）和双输出iPopQC的鲁棒性，发现双输出iPopQC更稳定，可以维持96h的生产。最后，研究人员也3-L罐上测试了iPopQC的鲁棒性，与无iPopQC的对照菌株相比，N-乙酰神经氨酸的产量实现了2.5倍增加。此研究为发酵过程中细胞异质性调控提供了新策略。

上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2018YFA0900300）、国家自然科学基金（31972854）、江苏省自然科学基金（BK20200085）、江苏省重点研发计划（BE2019628）等项目的资助。

图1 NeuAc合成中的细胞间变异和iPopQC 系统的设计

图2 用于偶联生长和合成的iPopQC 系统的表征

图3 验证 iPopQC 系统改进 NeuAc 合成的能力

图4 iPopQC通过富集生产细胞亚群改善生物合成效率

图5 iPopQC改善生产稳定性