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江南大学康振教授课题组:利用工程化毕赤酵母从头合成非动物源硫酸软骨素
2021-07-16

研究背景

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate, CS)是一种广泛分布在软骨组织中的线性糖胺聚糖,由葡萄糖醛酸(GlcA)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过 β(1→3) β(1→4)糖苷键交替连接并经过一定磺酸化修饰而成。根据硫酸化模式的不同,CS 可分为 CSA [GlcA-GalNAc (4S)]CSC [GlcA-GalNAc (6S)]CSD [GlcA (2S)-GalNAc (6S)] CSE [GlcAGalNAc (4, 6S)]CS 具有多种生理功能,在许多病理过程中发挥着关键作用,广泛应用于临床、医疗和营养保健等领域。例如,CSA CSC 已被开发成治疗骨关节炎及新关节软骨生成的药物和功能性食品。不同磺酸化程度的 CS 具有不同的生理功能。

然而,当前所有商业化的 CS 主要依赖于动物组织提取(例如,牛、猪、鸡或鲨鱼等)。这种生产模式存在许多问题,例如动物饲养周长、抗生素的使用、动物排泄物的污染、使用高温及酸碱提取、产品存在潜在的致病因子及产品结构不均一等。因此,为了有效解决上述问题,开发一条新的 CS 绿色合成路线显得十分必要。

近日,江南大学康振教授课题组通过工程化毕赤酵母,利用廉价的甲醇实现了非动物源硫酸软骨素的从头合成。该成果以“Biosynthesis of non-animal chondroitin sulfate from methanol using genetically engineered Pichia pastoris”为题发表在英国皇家化学会期刊 Green Chemistry 上,文章被选为封面 (back cover)和热点(hot spot 文章。

 

研究概述

为了有效解决硫酸软骨素生产过程中的问题,作者通过工程化的毕赤酵母,利用廉价的甲醇从头合成 CS。首先,将来自大肠杆菌 K4  kfoC  kfoA,及来自枯草芽孢杆菌的 tuaD 三个外源基因引入毕赤酵母,构建软骨素合成途径,得到 5.5 mg/L 的软骨素合成菌株。进一步通过密码子及基因组合优化,软骨素的产量提高了约 35 倍,达到 189.8 mg/L。对 6 Kozak 序列和 10 种不同的内源启动子进行比较和分析,实现了软骨素-4-O-磺基转移酶的活性表达(41.3 U/L)。整合软骨素合成模块和磺酸化模块后,工程菌株 Pp006 成功合成了 182.0 mg/L CS [GlcA-GalNAc (4S)],磺酸化度为 1.1%。通过过表达腺苷 5'-三磷酸硫酸化酶和腺苷 5'-磷酸硫酸激酶,强化了 3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)的供给,进一步将硫酸化度提高到 2.8%。在 3-L发酵罐分批补料培养中,CS 最高产量达到 2.1 g/L,硫酸化度提高到 4.0%。本研究为毕赤酵母细胞工厂代谢合成其他磺酸化糖胺聚糖奠定了基础。

 

文章导读

1. 动物组织提取法所存在的问题及微生物法的优势比较

2. 毕赤酵母中硫酸软骨素合成示意图。通过在毕赤酵母中引入外源基因 kfoCkfoA tuaD 疏通软骨素合成途径,进一步通过磺基转移酶 C4ST 的引入及 PAPS 合成途径的强化实现硫酸软骨素的合成及磺酸化水平的提升。

3. 毕赤酵母合成软骨素菌株的构建及软骨素结构分析。(A)软骨素合成途径的构建与优化。kfoC'kfoA'  tuaD' 分别为 kfoCkfoA tuaD 根据 P. pastoris 密码子偏好性优化后的序列。T2A T2A2 代表自切割端肽。(B)从毕赤酵母中提取的软骨素二糖的质谱图。通过 HPLC-MS(上)和 MS/MS(下)分析软骨素二糖。

4. C4ST 表达的优化。(A) 10 种不同的毕赤酵母内源启动子表达 C4ST,通过 C 端融合 eGFP 指示蛋白表达情况。(B) C4ST-GFP P. pastoris 细胞中的分布情况。比例尺=2.5 µm(C) 不同时间下 C4ST 细胞内酶活的变化。

5. HPLC-MS 分析软骨素和硫酸软骨素二糖的离子色谱图(A)和质谱图(B)

6. 增强 PAPS 合成以提高 CSA 的磺酸化度。(A) 不同重组菌株细胞内 PAPS 的水平。DCW,细胞干重。(B) Pp007 Pp008 菌株中硫酸软骨素的滴度和磺酸化程度。其中 Pp006 是没有强化 PAPS 合成途径的重组菌株,Pp007 Pp008 菌株分别过表达了来自酿酒酵母和毕赤酵母的腺苷 5'-三磷酸硫酸化酶(ATPS)和腺苷 5'-磷酸硫酸激酶(APSK)的编码基因。

7. 通过重组菌株 Pp008 的补料分批发酵生产硫酸软骨素。首先,从 22 小时到 33 小时,以 8 mL/(L·h)的速度流加 50% (m/v)甘油。此后,在 33 小时甘油补料终止,然后在 36 小时残留甘油消耗完后进入甲醇补料培养阶段。每 12 小时取样检测一次细胞干重、磺酸化程度和硫酸软骨素 A 的滴度。

 

论文信息

·              Biosynthesis of non-animal chondroitin sulfate from methanol using genetically engineered Pichia pastoris
Xuerong Jin, Weijiao Zhang, Yang Wang, Jingyu Sheng, Ruirui Xu, Jianghua Li*(李江华,江南大学), Guocheng Du and Zhen Kang*(康振,江南大学)
Green Chem., 2021,23, 4365-4374
http://doi.org/10.1039/D1GC00260K

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