透明质酸 (Hyaluronic acid, HA) 是一种由 D-葡萄糖醛酸 (GlcA) 和 N-乙酰D-葡萄糖胺 (GlcNAc) 重复二糖单元（β-1,3-GlcA 和 β-1,4-GlcNAc 交替连接）组成的线性多糖。凭借其优异的生物相容性、非免疫原性和卓越的保湿能力，HA 在生物医学、化妆品和食品工业中获得了广泛的应用。

     目前，HA 的工业生产主要依赖于兽疫链球菌 (Streptococcus zooepidemicus) 的微生物发酵。然而，这种生产方式面临两大挑战：首先，该菌株的致病性引发了生物安全方面的担忧；其次，其遗传难操作性极大地限制了通过基因工程手段优化 HA 产率的努力。

     为了应对这些挑战，无细胞的体外酶法合成 (cell-free enzymatic synthesis) 成为了一种极具吸引力的替代策略。该方法在体外重建简化的酶促途径，摆脱了细胞壁和细胞膜等物理屏障，规避了宿主细胞复杂的代谢网络。因此，酶法合成具有高精度、强可控性和高产物纯度（如内毒素污染极低）等显著优势，并能简化下游纯化流程。

    尽管体外合成潜力巨大，但其广泛应用长期以来受到一个关键瓶颈的制约：高昂的底物成本。HA 的生物合成依赖于两种活化的核苷酸糖前体——UDP-GlcNAc 和 UDP-GlcA。这些高价值化合物的市场价格非常昂贵，使得依赖其作为起始原料的体外合成在经济上不具备可行性。因此，开发一种能够利用廉价原料、经济高效地原位合成这些前体的系统，是实现 HA 体外合成规模化生产的核心难题。

    本研究的作者们设计并建立了一个精巧的无细胞酶促级联系统，通过八种途径酶 (eight pathway enzymes)，将 HA 的从头合成 (de novo synthesis) 与前体供应及核苷酸回收 (nucleotide recycling) 整合在同一个反应体系中。

该系统的总体蓝图如方案1所示，它巧妙地分拆为三个协同作用的功能模块：

·         模块一：前体合成模块。利用核苷酸糖补救途径 (salvage pathways)，以廉价的单糖 GlcNAc 和 GlcA 为起始原料，在 ATP 和 UTP 存在下，通过四种酶（NahK, GlmU, GlcAK, USP）高效合成 HA 的两大直接前体：UDP-GlcNAc 和 UDP-GlcA。

·         模块二：聚合模块。利用核心的透明质酸合酶 (HAS)，催化模块一提供的等摩尔前体，交替进行糖基转移，聚合成高分子量的 HA 链。

·         模块三：辅因子再生模块。这是确保系统经济性的关键。利用三种酶 (PPK3, URA6, PmPpA) 构成的循环，持续再生反应中消耗的昂贵辅因子 ATP/UTP，同时清除抑制性副产物。

该研究所选用的全部八种关键酶的详细信息，包括其来源、EC 编号和催化的反应，总结于表1中。

方案1. HA 前体分子的合成代谢途径和本研究中的 HA 无细胞生物合成途径

表1. 本研究中用于 HA 合成的候选酶

     在该系统中，每一个酶都至关重要。特别值得注意的是无机焦磷酸酶 (PmPpA) 的加入。在前体合成模块中，GlmU 和 USP 的反应都会产生副产物焦磷酸 (PPi)。根据化学平衡原理，PPi 的积累会抑制这两个反应的正向进行，从而“堵塞”整个 HA 合成通路。PmPpA 的功能就是水解 PPi，将其转变为磷酸盐 (Pi)，从而解除这一抑制效应，强有力地“拉动”反应平衡向产物方向移动，确保了前体合成的高效进行。

     在构建完整系统之前，作者首先对模块一（前体合成）进行了细致的优化 (3.1. Setup of the UDP-GlcNAc and UDP-GlcA Synthesis Reactions)。如方案2所示，该模块包含两条平行的酶法路径，分别用于合成 UDP-GlcNAc 和 UDP-GlcA。图1b的 SDS-PAGE 结果证实了模块一所需的四种酶（来自Bifidobacterium longum的 BlNahK、来自Escherichia coli的 EcGlmU、以及来自Arabidopsis thaliana的 AtGlcAK 和 AtUSP）均获得了成功的异源表达和纯化。

方案2. HA前体的酶法合成

随后，作者对该模块进行了两轮关键优化：

3.1 底物比例优化

    作者首先探究了起始底物（单糖, ATP, UTP）的摩尔比例对两种前体产率的影响。如图1c和图1d所示：

·         对于 UDP-GlcNAc 的合成，当 GlcNAc/ATP/UTP 的摩尔比为 1:1:1 时，获得了最高的产率 (46%)。

·         对于 UDP-GlcA 的合成，则是在 GlcA/ATP/UTP 摩尔比为 2:1:1 时，产率最高 (36%)。

这一结果清晰地表明，两条平行通路具有不同的最适底物需求。

3.2 酶载量优化：从“最大化产率”到“平衡通量”

    上述差异化的最适比例带来了一个新问题：下游的 PmHAS 聚合反应需要等摩尔 (equimolar) 的 UDP-GlcNAc 和 UDP-GlcA。如果简单地按照各自的最优条件生产，必然会导致一种前体过剩而另一种前体不足，从而限制 HA 的总产量。

     因此，作者的策略目标从“最大化单一产率”转变为“实现相似的形成速率以平衡通量”。为此，他们系统地改变了四种生物催化剂 (BlNahK, EcGlmU, AtGlcAK, AtUSP) 的比例 (mg/mL)。如图1e所示，最终找到了一个“黄金比例”：当四种酶的比例为 1:1.5:1.5:2 (BlNahK:EcGlmU:AtGlcAK:AtUSP) 时，系统达到了理想的平衡状态：UDP-GlcNAc 的转化率达到 79.7%，而 UDP-GlcA 的转化率达到 68.6%。在这一条件下，两条通路能够以相似的速度稳定地供给下游所需的两种前体。

图1. UDP-GlcNAc和UDP-GlcA合成的组合优化

     解决了前体供应问题后 (3.2. Cell-Free Biosynthesis of HA)，研究团队转向了核心的聚合酶——来自Pasteurella multocida的 PmHAS。这是一个巨大的挑战：PmHAS 是一种膜相关蛋白 (membrane-associated protein)，其序列中含有疏水区域。这些区域在活细胞中对于引导 HA 链跨膜转运至关重要，但在体外的水相反应体系中，它们会导致蛋白质的错误折叠、聚集和失活，使其难以实现可溶性表达。

4.1 截短突变体的理性设计与筛选

     为解决这一关键的溶解性问题，作者采用了一种现代生物工程策略：截短其膜相关结构域。他们首先使用了一个名为 DeepSoluE 的深度学习算法，in silico（通过计算）预测了一系列不同截短突变体的溶解度。构建的截短体包括 PmHASA2-45, PmHASA2-75, PmHASA2-95, PmHASA710-972, PmHASA800-972 和 PmHASA900-972。

如图2a的预测结果所示，PmHASA710-972（即去除了 N 端和 C 端的特定疏水区）被预测具有最高的溶解度。随后的实验验证（图2b的 SDS-PAGE 分析）完美证实了这一预测：只有 PmHASA710-972 突变体成功实现了可溶性表达，为后续的体外合成奠定了基础。

方案3. 通过HAS的原位活化核苷酸前体合成HA

4.2 产物HA的严格表征

     利用可溶的 PmHASA710-972 酶和模块一的前体，作者在方案3所示的级联反应中成功合成了HA。为了确证产物的身份，进行了严格的化学和生物化学表征：

1.      红外光谱 (IR) 分析 (图2c)：将合成产物的 IR 光谱与 HA 真实参考标准品（European Pharmacopoeia）进行对比。结果显示，两条图谱完全匹配 (matched)，证明合成产物具有 HA 特有的化学官能团结构。

2.      酶降解与质谱 (LC-MS) 分析 (图2d)：这是更具特异性的“指纹”鉴定。研究团队使用透明质酸酶 (hyaluronidase)——一种特异性降解 HA 的酶——处理合成产物。LC-MS 分析显示，经过4小时的酶解，高分子量的 HA 被完全降解，只产生了一个单一的、占绝对主导地位的峰，其质荷比 (m/z) 为 377。这个值与 HA 的二糖重复单元 (GlcNAc-GlcA) 的理论分子量完全一致。

这两项证据（化学结构匹配和生物学特异性降解产物一致）强有力地证明了该无细胞系统合成的产物确切无疑是透明质酸。

4.3 产物分子量

      凝胶渗透色谱法 (GPC) 分析表明，合成的 HA 产物分子量 (MW) 分布较广，范围从 1.28 × 10⁴ Da 到 1.02 × 10⁶ Da。产物主要由三种组分构成：1.28 × 10⁴ Da (占51%), 1.33 × 10⁵ Da (占36%), 和 1.02 × 10⁶ Da (占13%)。作者指出，虽然合成是成功的，但如何调控这一分子量分布以满足不同应用的需求，将是未来需要进一步优化的方向。

图2. HA的合成与产物表征

     虽然模块一和模块二已经能合成 HA，但其反应仍然化学计量地消耗昂贵的 ATP 和 UTP，不具备经济可行性。因此，模块三（辅因子再生） (3.3. Construction of a Nucleotide Sugars Recycling System) 是本研究从“可行”走向“实用”的胜负手。

如方案4所示，作者设计了一个精巧的双循环再生系统，其核心组件包括：

·         多聚磷酸盐激酶 (PPK3)：它以极其廉价的多聚磷酸盐 (PolyP) 作为磷酸供体，将反应中生成的 ADP 和 UDP 分别再生为 ATP 和 UTP。

·         尿苷酸激酶 (URA6)：系统中的“废物”UMP（由 PmHAS 反应或 UDP 分解产生）可被 URA6 利用 ATP 再生为 UDP，随后 UDP 再进入 PPK3 循环，被转化为 UTP。

图3a的 SDS-PAGE 结果证实了这三种再生酶（RpPPK3, PmPpA, AtURA6）均成功表达。

方案4. 提出的利用多聚磷酸盐激酶(PPK3)从其二磷酸核苷中原位再生ATP和UTP的途径

该系统的有效性通过对比实验得到了有力证明：

·         对照组 (无回收系统，图3c)：如图所示，在没有回收系统时，ATP 和 UTP 在反应开始后被迅速消耗，导致其二磷酸（ADP, UDP）和单磷酸（UMP）形式的大量积累。

·         实验组 (有回收系统，图3d)：该系统的强大之处在于，它甚至可以仅使用最廉价的 UMP 作为起始底物。图3d显示，加入回收系统后，UMP 在短短 0.5 小时内就被迅速转化为 UDP 和 UTP，证明了该循环极高的再生效率。

更重要的是，当回收系统启动后，ATP 的净消耗量显著降低。数据显示，在反应12小时后，回收系统中产生的 ADP 仅为无回收系统时的 53.6%。这证明该系统成功地将昂贵的 ATP/UTP 从化学计量的“消耗品”转变为催化量的“穿梭载体”，极大地降低了成本。

     最后 (3.4. Cell-Free Enzyme Cascade for the De Novo Synthesis of HA)，作者在 50 mL 反应体系中，将所有三个模块（前体合成 + 聚合 + 辅因子再生）进行了整合，实现了 HA 的从头合成。

该过程采用了一种巧妙的两步序贯添加策略：

1.      第 0-8 小时：首先运行模块一和模块三。如图3e所示，在 8 小时内，UDP-GlcNAc 和 UDP-GlcA 的产率均超过了 60%。这一步的目的是“预充电”，为后续的聚合反应积累高浓度的底物。

2.      第 8-24 小时：在第 8 小时，加入核心的聚合酶 PmHAS（模块二）。

      这一策略背后的工艺逻辑是：通过先积累高浓度的前体，可以确保 PmHAS 在加入后处于底物饱和状态，从而以最高效率驱动聚合反应，并可能有助于合成更高分子量的产物。

     最终的生产动力学如图3f所示：在第8小时加入 PmHAS 后，前体（UDP-GlcNAc 和 UDP-GlcA）浓度开始迅速下降，而被消耗的前体则被转化为 HA，导致 HA 产量稳步增加。在反应 24 小时后，HA 的最终产率达到了 1.28 g/L。

图3. 核苷酸循环系统的构建与验证

     本研究成功开发了一个集成了前体合成、聚合和辅因子再生的无细胞酶促级联系统，用于经济高效地合成透明质酸。该系统利用五种关键途径酶将低成本底物 (GlcNAc 和 GlcA) 转化为高价值的 HA，并通过“一锅法”中耦合的核苷酸回收模块 (PPK3, URA6, PmPpA)，消除了对昂贵核苷酸糖进行纯化的需求，同时解决了 PPi 的抑制问题。

    最终，该优化系统在 24 小时内实现了 1.28 g/L 的 HA 产量，底物转化率达到 65.9%，产物分子量范围为 1.28 × 10⁴ 至 1.02 × 10⁶ Da。

    这项工作不仅为 HA 的规模化生产提供了一个具有成本效益的平台，更重要的是，它建立了一个模块化的酶促蓝图 (modular enzymatic blueprint)。理论上，通过替换模块一和模块二中的关键酶（例如，使用其他糖基转移酶和相应的 UDP-糖合成酶），该平台可以被改造用于工程化其他高价值的糖胺聚糖 (glycosaminoglycans)，在合成糖生物学领域展现了广泛的应用前景。