摘要

   海藻糖因其高稳定性与蛋白保护特性，广泛应用于医药、食品与化妆品领域。然而，传统由TreY/TreZ催化的两步法体系受限于酶性能不足与短链麦芽寡糖副产物积累，转化率长期偏低。本研究基于计算机辅助酶工程，成功获得兼具高热稳定性与高催化效率的TreY与TreZ突变体；其中TreZ-T212P热稳定性提升32.3%，TreY-M1活性与稳定性分别提升0.63倍与2.97倍。进一步筛选得到来源于Corallococcus sp. EGB的4-α-葡聚糖转移酶CSMalQ，通过循环利用短链寡糖实现底物高效再生。最终构建的三酶级联体系在廉价麦芽糊精底物上实现了84.31%海藻糖转化率，创目前最高纪录，为海藻糖绿色高效生物制造提供了全新路径。

本研究以麦芽糊精转化为海藻糖的生物合成体系为研究对象，成功实现了A. ramosus 来源的TreY（MTSase）与TreZ（MTHase）在大肠杆菌中的异源高效表达。与S. solfataricus同源酶相比，这两种酶在中温条件下表现出更高的比活力（5130 U/g与5890 U/g）和优异的热稳定性。通过优化表达启动子（BAD）及发酵条件，显著提高了酶的可溶性与胞内活性。以麦芽糊精为底物的协同反应体系在60 °C下实现了最高62.5 %的转化率，经优化后进一步提升至67.8 %。该研究构建了高效、可调控的海藻糖生物转化平台，为低成本工业化生产提供了新的酶工程思路与工艺基础。

图1. TreY和TreZ在大肠杆菌中的异源表达及其在海藻糖生物转化中的作用

本研究基于计算驱动的酶工程策略，针对TreY在麦芽糊精转化过程中的稳定性与活性不足问题，整合Consensus Finder、PROSS与FireProt多算法协同预测，筛选出稳定性增强突变位点。实验验证显示，G553P与T606V突变显著提升酶的热稳定性。随后通过分子对接与功能位点扫描，鉴定出可提高底物亲和力的V260D突变。在此基础上构建的复合突变体M1（V260D/G553P）表现出催化活性提升0.63倍、热稳定性提高近3倍的优异性能。结构分析表明，这些突变协同增强了蛋白的局部刚性与分子内氢键网络。该研究展示了理性设计与实验验证相结合的高效酶优化路径，为高性能海藻糖合成酶的构建提供了可推广的范例。

图2. TreY的结构导向工程，以提高热稳定性和催化效率

通过100 ns分子动力学模拟，本研究揭示了TreY突变体M1在结构与催化性能上的分子机制。相比野生型，M1在约40 ns后达到构象平衡，RMSD由1.9 Å降至1.7 Å，显示出更高的结构刚性。RMSF分析表明，G553P突变显著降低了局部柔性，而V260D则主要增强底物结合。进一步的酶-底物复合体系模拟显示，野生型酶的麦六糖底物在18 ns后解离，而M1可稳定结合达70 ns。其增强的结合力来源于新形成的氢键网络（I263、R269、R290、E298），稳定了催化中心与底物的空间构型。该研究揭示了结构刚性与活性协同提升的分子基础，为理性设计高稳定、高效率的海藻糖合成酶提供了关键理论支撑。

图3. MD模拟揭示了TreY突变体M1的结构稳定机制

本研究针对TreZ在麦四糖基海藻糖转化中的热稳定性与催化效率不足，结合AlphaFold 3结构预测与分子动力学模拟开展理性设计。通过RMSF分析识别柔性区域并引入结构导向突变，最终筛得T212P突变体，其在60 °C下半衰期达342.72 min，残余活性提升32.3 %。分子模拟显示，T212P显著降低局部构象波动（RMSD = 1.9 Å），并形成新的氢键网络（P212–底物、Q383–底物），稳定催化环区并优化底物定位，从而提升催化效率。相比之下，多点突变破坏了关键结构相互作用，反致稳定性下降。该研究揭示了单点突变驱动的结构刚化与活性协同机制，为高稳态海藻糖合成酶的精准设计提供了重要理论依据。

图4. 通过定点突变增强TreZ的酶学性质

为解决TreY/TreZ催化体系中短链麦芽寡糖副产物积累导致的底物利用率下降问题，本研究提出了基于4-α-葡聚糖转移酶（4αGT）的副产物循环策略。通过DeepMolecules平台筛选并预测十种候选酶的催化效率与可溶性，最终确定CSMalQ（来源于Corallococcus sp. EGB）作为最优酶种。该酶在E. coli中高效可溶表达，最适温度为50 °C，在60 °C下半衰期为79.52 min。将其整合入TreY/TreZ体系后，海藻糖转化率提升至82.63 %，副产物峰显著消失。结构与分子对接结果表明，CSMalQ通过柔性环区形成多重氢键稳定底物结合，实现短链寡糖的循环再利用。该策略实现了反应体系的闭环优化与底物全转化，为高效海藻糖生物制造提供了新途径。

图5. 筛选用于短链麦芽低聚糖回收的4αGTs

为验证三酶协同体系的工业化潜力，本研究在15 L发酵罐中实现了TreY、TreZ与CSMalQ的规模化表达。TreY在无明显指数期的条件下仍实现高密度生长（OD₆₀₀ = 125.2），TreZ与CSMalQ则表现出典型的发酵动力学特征。经发酵获得的粗酶液用于麦芽糊精转化，海藻糖产率提升至84.31 %，创同类体系最高纪录。该结果表明，多酶级联反应与半理性蛋白设计的整合显著提升了转化效率与底物利用率，实现了低成本、高产率、可持续的海藻糖绿色制造。这一研究为海藻糖工业化生产提供了切实可行的生物精炼新路径，推动产业向高效与零废弃方向迈进。

图6. 在15-L发酵罐中分批补料发酵TreY、TreZ和CSMalQ，随后进行海藻糖转化

总结与展望

以往TreY/TreZ的改造常陷入热稳定性与催化活性难以兼得的困境。本研究通过分步突变优化与协同组合，实现了两者的协同提升；随后引入具有短链麦芽寡糖循环能力的CSMalQ，构建了高效三酶级联体系，显著改善底物利用率。该体系在麦芽糊精底物上实现了84.31 %的海藻糖转化率，刷新了已报道的最高纪录。研究展示了酶工程与生物过程集成的协同优势，为海藻糖的工业级绿色生物制造提供了新范式，也为复杂碳源的闭环催化转化开辟了新的技术路径。

论文相关信息

文章信息：

Engineering a cyclic enzymatic cascade for efficient trehalose biosynthesis from maltodextrin substrates

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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852425015470?via%3Dihub