摘要：

肺炎链球菌3型荚膜多糖（type 3 capsular polysaccharide，Type 3 CPS）作为肺炎链球菌重要的毒力因子，在疫苗开发、多糖材料等方面具有重要价值。该文旨在构建合成Type 3 CPS的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌细胞工厂，并探索其发酵合成方法。首先对Type 3 CPS的基因簇、合酶结构和糖链结构进行分析，在此基础上过表达Type 3 CPS合酶Cps3B和Type 3 CPS单糖前体的合成途径相关酶，并分析辅助膜蛋白CpsC对Type 3 CPS合成的影响。谷氨酸棒杆菌细胞工厂的合成水平达到69 mg/L，随后构建大肠杆菌细胞工厂合成水平达到79 mg/L。为进一步提高Type 3 CPS合成，引入Type 3 CPS的辅助膜蛋白CpsC，Type 3 CPS合成水平提高至105 mg/L。最后通过结构模拟和分子动力学模拟，发现辅助蛋白CpsC通过与Type 3 CPS合酶Cps3B形成氢键作用参与Type 3 CPS糖链合成与跨膜转运过程。本研究首次实现Type 3 CPS细胞工厂的构建和优化，为Type 3 CPS的发酵合成奠定了初步基础。

关键词：

肺炎链球菌；肺炎链球菌3型荚膜多糖；CpsC；发酵合成；分子动力学

主要结论

肺炎链球菌3型荚膜多糖（Type 3 CPS）是肺炎链球菌胞外多糖之一，由葡萄糖和葡萄糖醛酸两种单糖交替链接而成，线性不分枝、带负电，与链球菌的透明质酸胞外多糖具有一定的结构相似性。文章基于蛋白质结构模拟发现肺炎链球菌3型荚膜多糖合酶（Cps3B）与链球菌透明质酸合酶（HasA，I型透明质酸合酶）结构高度相似，均属于连续性糖基转移酶（GT2）家族。该类酶具有聚合延长和跨膜转运糖链的双重功能，并由其跨膜α螺旋束构成糖链分泌通道。但是发现Cps3B的第一跨膜螺旋TM1与HasA的TM1相比出现明显截短（图1）。

图1 肺炎链球菌3型荚膜多糖合酶（Cps3B）与化脓链球菌透明质酸合酶（HasA）结构比较。ppm3代表模拟的细胞膜结构

基于透明质酸细胞工厂构建经验，首先尝试在谷氨酸棒杆菌中异源表达Cps3B，并在此基础上协同强化表达GalU和Ugd以增强两类单糖前体UDP-葡萄糖和UDP-葡萄糖醛酸的供给。构建的谷氨酸棒杆菌细胞工厂以葡萄糖碳源进行分批发酵，Type 3 CPS合成水平约70 mg/L（图2）。

图2 过表达Cps3B、GalU和Ugd的谷氨酸棒杆菌分批发酵合成Type 3 CPS

随后更换大肠杆菌为底盘，异源表达Cps3B、GalU和Ugd。由于谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的细胞膜结构不同，Cps3B合成的Type 3 CPS会释放到大肠杆菌周质空间，进而被外膜结构包被。通过相差显微镜观察到Type 3 CPS在周至空间积累，合成水平达到80 mg/L左右（图3）。

图3 过表达Cps3B、GalU和Ugd的大肠杆菌分批发酵合成Type 3 CPS

鉴于Cps3B的TM1比HasA的TM1出现了显著截短（图1），且两类细胞工厂合成Type 3 CPS水平远低于透明质酸（Nature Communications, 2020 (11) :3120），研究人员推测Cps3B可能需要其他蛋白亚基辅助完善其Type 3 CPS的合成或分泌功能。通过对肺炎链球菌cps3B临近基因进行分析发现另一个膜蛋白编码基因cpsC。在上述大肠杆菌细胞工厂中额外表达CpsC，Type 3 CPS合成水平提高到了105 mg/L（图4）。

图4 过表达Cps3B、GalU、Ugd和CpsC的大肠杆菌分批发酵合成Type 3 CPS

为了分析CpsC促进Cps3B合成Type 3 CPS的可能的原因，论文对Cps3B与CpsC进行了蛋白复合体建模和分子动力学模拟。模拟结果推测CpsC与Cps3B截短的TM1之上的氨基酸形成动态氢键，稳定了Cps3B的TM1跨膜区域，进而完善了Type 3 CPS的跨膜转运过程（图5）。

图5 Cps3B与CpsC的蛋白质复合体预测与基于分子动力学模拟的互作分析

引用格式

程剑, 成国森, 孔天爱, 等. 肺炎链球菌3型荚膜多糖细胞工厂的构建[J]. 食品与发酵工业, 2025, 51(17): 1-10.