肝素是临床最重要的抗凝药物之一，目前主要从猪小肠中提取，存在供应链不稳定、批次异质性和病原污染风险。，针对肝素生物合成中的关键限速酶——鸡源6-O-磺酸基转移酶（Ga6OST1），首先在毕赤酵母中通过分泌工程实现了高效表达，再结合半理性设计获得三突变体A77R/V107L/V248T。该变体的比活提高2.4倍，催化周转数（kcat）提升2.3倍，37°C半衰期延长5.3倍，熔融温度提高2.77°C。分子动力学模拟揭示，突变通过引入盐桥、强化疏水堆积和氢键网络，增强了酶的结构刚性。最终，该突变体对N,2-O-硫酸化肝素前体的6-O-硫酸化程度达到75.7%，接近商业猪肠肝素水平。这项研究为生物工程化肝素的低成本、大规模生产提供了关键酶模块。

肝素：动物提取的“金标准”背后的隐患

肝素是一种高度硫酸化的线性糖胺聚糖，近百年来一直是临床抗凝治疗的基石。但它目前主要从猪小肠黏膜中提取，不仅依赖养殖业，还存在供应链波动、批次间结构不均一以及潜在的病原污染（如非洲猪瘟、朊病毒）等风险。化学合成肝素因结构复杂、成本极高而不可行。因此，利用酶法体外合成“生物工程肝素”成为理想替代方案。

肝素的生物合成需要一系列磺酸基转移酶依次修饰，其中6-O-磺酸基转移酶（6OST） 催化将硫酸基从PAPS转移到葡萄糖胺6位羟基上。这个修饰直接影响肝素的抗凝血活性——它与3-O-硫酸化共同构成抗凝血酶结合的五糖关键结构。然而，6OST1（尤其是来自鸡的Ga6OST1）的催化效率低、热稳定性差，成为整个合成路径的限速步骤。以往研究中，人们甚至需要同时使用6OST1和6OST3两个酶才能达到足够的硫酸化程度，大大增加了工艺复杂性。

首先，为什么选择毕赤酵母而不是大肠杆菌？

作者比较了MBP标签融合的Ga6OST1在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达。结果显示，毕赤酵母来源的酶比活力（155.0 U/mg）略高于大肠杆菌来源（132.1 U/mg）。进一步的序列分析发现，Ga6OST1存在三个潜在的N-糖基化位点（N261、N317、N328）（图2A）。通过逐一突变为谷氨酰胺来消除糖基化，结果发现N261Q和N328Q突变导致蛋白分泌量下降约23-27%，表明这两个位点的糖链可能有助于折叠或分泌稳定性。而N317Q突变虽然蛋白量未明显下降，但比活力降低了33.6%，且对底物的Km值增加了43.9%（图2B-G），暗示该位点的糖基化可能邻近PAPS结合口袋，影响催化效率。尽管如此，所有糖基化突变体的残余活性仍高于大肠杆菌表达的野生型。因此，团队选择毕赤酵母作为表达宿主，并保留天然糖基化位点。

模块化分泌工程：让酶“出得去、活得好”

为了进一步提高胞外酶活，作者对分泌路径进行了系统优化（图3A）。首先比较了多种信号肽——包括酿酒酵母α因子、OST1信号肽、毕赤酵母内源PAS、SCW10、UTH1，以及将α因子的前导序列与后三者融合形成的嵌合体。结果显示，野生型α因子信号肽效果最佳，胞外活性达5.7 U/mL。随后筛选融合标签，发现MBP（麦芽糖结合蛋白）效果最优，远优于SUMO和GST。接着优化MBP与Ga6OST1之间的连接肽，发现短刚性连接肽(EA₃K)₁在稳定性和活性上最佳，胞外活性提升至6.6 U/mL。

接下来，团队共表达了多种分子伴侣：转录调节因子Aft1、Hac1，折叠因子BiP、Ero1，以及分泌运输辅助因子SEC53、Sso2（图3C）。其中Sso2（SNARE复合体组分，参与胞吐后期）效果最突出，将胞外活性进一步推高至12.0 U/mL，比未优化时提高约4.2倍（相对于无标签对照约2.1倍）（图3D）。同时共表达Ero1和SEC53也有一定提升，但组合共表达反而没有叠加效应，可能增加了代谢负担。

半理性设计：20个热点中筛出稳定突变

尽管分泌优化提升了产量，但Ga6OST1本身的热稳定性仍不足：37°C孵育2小时后残余活性仅约75%。为了提高酶自身的稳定性，团队采用半理性设计策略。首先用AlphaFold2预测Ga6OST1结构，结合HotSpot Wizard分析柔性残基和空腔，再对90条同源序列进行多序列比对和祖先序列重构，筛选出20个位于催化核心之外但可能影响局部堆积或静电网络的候选位点（图4A-B）。这些位点分布在酶的多个区域（图4B）。

将这些位点分别突变为更有利于疏水堆积或静电相互作用的氨基酸（如Val→Leu, Ala→Arg, Ser→Pro等），构建单点突变体库。在37°C热处理2小时后测定残余活性，发现多个突变体的热稳定性显著优于野生型（图4C）。其中V248T、N169L、S220P、V107L、A77R分别提高了1.8、1.6、1.5、1.3、1.2倍。将这些正向突变组合后，三突变体A77R/V107L/V248T表现出最佳的残余活性，比野生型提高了2.7倍（图4D）。该组合被命名为工程化MBP-Ga6OST1，用于后续详细表征。

酶学性质：比活、kcat、半衰期全面跃升

纯化后的工程酶与野生型进行对比（图5）。比活力从155.0 U/mg提升至374.1 U/mg（提高2.4倍，图5A）。动力学分析显示，工程酶的kcat从34.58 s⁻¹升至81.13 s⁻¹（提升2.3倍），而Km几乎没有变化（18.40 vs 17.75 mg/L），因此催化效率kcat/Km提升了2.4倍（图5B-C）。这表明突变主要提高了催化速率而非底物亲和力。

最适温度分析显示两者均在37°C最佳（图5D）。在37°C下的稳定性测试中，野生型半衰期仅为5.3小时，而工程酶达到28.1小时，延长了5.3倍（图5E）。差示扫描量热（thermal shift assay）显示工程酶的熔融温度Tm从55.41°C提高到58.18°C，增加了2.77°C（图5F），直接证明热稳定性的提升。

分子机制：盐桥、疏水堆积、氢键协同增强刚性

为了解释突变如何稳定酶结构，作者进行了200 ns的分子动力学模拟（图6）。A77R突变引入了一个长链带正电的精氨酸，与相邻的Glu75形成新的盐桥，增强局部静电网络（图6A）。V107L突变为体积更大的亮氨酸，埋入疏水核心，与Phe309、Trp133、Phe301等形成更强的疏水堆积，溶剂可及表面积（SASA）从11.475 Å⟡降至10.404 Å⟡，说明埋藏更深（图6B）。V248T突变为苏氨酸，引入两个额外的氢键，稳定了邻近α-螺旋及其与环区的相互作用（图6C）。

RMSF分析显示，工程酶在突变位点附近的残基柔性明显降低（图6D）。RMSD轨迹表明工程酶更快达到平衡，且整体波动更小（图6E）。回转半径Rg显示工程酶结构更紧凑、更早稳定（图6F）。这些模拟结果一致说明，三点突变协同作用增强了酶的整体刚性，从而提高了热稳定性和催化耐久性。

底物适应性：从非硫酸化到高度硫酸化，效率全面提升

6OST的一个独特优势是底物谱较宽，可以作用于不同硫酸化程度的肝素前体。作者测试了三种底物：非硫酸化的肝素糖（heparosan）、N-硫酸化肝素糖、N,2-O-硫酸化肝素糖（图7）。对于非硫酸化底物，野生型仅能将7.05%转化为6-O-硫酸化产物，而工程酶达到30.08%，效率提高4.26倍。对于N-硫酸化底物，工程酶转化率79.02%（野生型24.96%）。对于最接近最终产品的N,2-O-硫酸化底物，工程酶达到了75.70%的6-O-硫酸化程度，而野生型仅38.67%。值得注意的是，75.7%的6-O-硫酸化水平与商业猪肠肝素的约77%十分接近，表明工程酶具备了生产高质量生物工程肝素的潜力。

总结：突破肝素生物合成的“限速关”

本研究系统解决了Ga6OST1表达差、活性低、稳定性差三大难题：

表达优化：在毕赤酵母中利用α信号肽、MBP标签、短刚性连接肽，以及共表达Sso2分子伴侣，使胞外酶活提高约4.2倍。

半理性设计：基于进化分析和结构预测，筛选出20个热点，获得三突变体A77R/V107L/V248T，比活提高2.4倍，半衰期延长5.3倍，Tm提高2.77°C。

机制阐明：MD模拟揭示盐桥、疏水堆积、氢键网络协同增强结构刚性。

应用验证：工程酶对N,2-O-硫酸化底物的6-O-硫酸化程度达75.7%，接近天然肝素标准。

该工作不仅为肝素的绿色生物制造提供了一个高效、稳定的催化模块，也展示了“真核表达优化+半理性设计”改造磺酸基转移酶的通用策略。未来，将工程Ga6OST1与其它修饰酶（NDST、2OST、3OST）级联，有望实现全酶法合成结构均一的生物工程肝素，彻底摆脱对动物来源的依赖。

原文信息：Xinjing Wang, Yaxin Yu, Ping Dong, Daoan Wang, Ruirui Xu, Guocheng Du, Xintong Xi, Zhen Kang. ACS Synthetic Biology, 2026, 15, 2160-2172. DOI: 10.1021/acssynbio.6c00237

通讯作者：Zhen Kang（康振）、Xintong Xi（席心彤），江南大学

第一单位：江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室