3月22日，重点实验室李子杰团队在Chemical Engineering Journal（IF:13.2）发表题为《High-efficiency production of lacto-N-triose II through combinatorial metabolic strategies in Saccharomyces cerevisiae》的研究论文。该研究基于组合代谢策略，在酿酒酵母中构建乳糖-N-三糖II（LNT II）高效合成体系，摇瓶产量达1.2 g/L，5 L发酵罐产量18.1 g/L，为目前酵母合成LNT II最高报道水平。以下为全文整理解读。

一、LNT II合成底盘菌株的构建

以酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株，搭建完整LNT II合成通路：

1.整合乳酸转运蛋白基因LAC12，赋予酵母乳糖摄取能力；

2.筛选高活性β-1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶lgtA-1，实现LNT II合成；

3.优化LAC12与lgtA-1拷贝数，确定2拷贝LAC12+1拷贝lgtA-1为最优组合，初始菌株YS05摇瓶产量0.151 g/L。

二、限速酶Gfa1p鉴定与定向进化

明确Gfa1p为LNT II合成限速酶，受磷酸化与UDP-GlcNAc反馈双重调控：

1.定点突变关键位点（Arg196、Lys197、Ser199），构建Gfa1p突变文库；

2.开发乳糖响应型抑制筛选平台，结合流式细胞分选（FACS）高通量筛选；

3.获得最优突变体Gfa1pᴿ¹⁹⁶ᴷ^-ᴷ¹⁹⁷ᴴ，菌株YS14产量提升至0.389 g/L，为初始菌株的2.57倍。

三、三大乳糖响应生物传感器开发

基于酵母内源GAL调控系统，构建3种适配不同场景的乳糖传感器：

1.LacGAL v1：响应范围宽（0–2 g/L），适合高通量筛选；

2.LacGAL v2：删除GAL1阻断半乳糖代谢，灵敏度高、诱导强度大；

3.LacGAL v3：敲除MIG1解除葡萄糖抑制，可在葡萄糖培养基中响应乳糖。

四、己糖胺通路强化与辅因子供给优化

强化前体UDP-GlcNAc供给，系统过表达通路关键基因：

1.过表达GNA1、PCM1、QRI1，提升己糖胺通路通量；

2.强化乙酰辅酶A与UTP供给，共表达ALD6、ADH2；

3.组合优化后菌株YS33摇瓶产量达0.644 g/L。

五、CRISPRi精准下调竞争通路

采用dCas9-Mig1介导的CRISPRi系统，精准抑制竞争代谢支路：

1.下调糖酵解：PFK1、PFK2、PFK26、PFK27；

2.下调磷酸戊糖途径：ZWF1；

3.下调己糖代谢：PGM1、PGM2、PMI40；

4.多靶点组合抑制，菌株YS34摇瓶产量突破1.2 g/L。

六、5 L发酵罐分批补料发酵验证

最优菌株YS34在5 L发酵罐中表现：

1.发酵120 h，LNT II产量18.1 g/L；

2.乳糖转化率0.71 mol/mol，生产强度0.15 g/L/h；

3.连续传代12代产量稳定，具备工业化应用潜力。

该研究建立“通路搭建+酶定向进化+生物传感器筛选+CRISPRi全局调控”的一体化策略，首次在酿酒酵母中实现LNT II高效合成，为母乳低聚糖（HMOs）真核生物制造提供全新技术方案。