1.    内源酰基转移酶（LPAT、GPAT）底物偏好不饱和脂肪酸，导致棕榈酸（C16:0）难以定向酯化至 sn-2 位；

2.    脂肪酸组成不适配：C16:0 和油酸（C18:1）比例低，且无法合成亚油酸（C18:2），限制 OPO 合成并阻碍 OPL 生产；

3.    二酰甘油酰基转移酶 DGA1 催化效率低，是 TAG 合成的关键瓶颈，直接制约产物产量。

🔬 研究方法

1. HMF 合成模块重构

·         异源表达偏好 C16:0-CoA 的酰基转移酶（拟南芥 rmBnLPAT1、莱茵衣藻 mCrlPAAT1/2），并融合内质网（ER）信号肽，确保酶定位至 TAG 合成位点；

·         敲除内源偏好不饱和脂肪酸的 LPAT 基因（SLC1、ALE1、LOA1），减少底物竞争，强化 C16:0 在 sn-2 位的酯化。

2. 脂肪酸组成修饰

·         替换内源 Δ9 去饱和酶 OLE1 为P. graminis PgOLE1（偏好 C18:0），降低棕榈油酸（C16:1）比例，提升 C18:1 含量；

·         表达小鼠脂肪酸延长酶 MmELVOL6，将 C16:0 转化为硬脂酸（C18:0），进一步提升 C18:1 产量；

·         异源表达解脂耶氏酵母 Δ12 去饱和酶 FAD2，构建 C18:2 合成通路，实现 OPL 从头合成；优化 FAD2 表达强度（选用 CCW12p 启动子），平衡 C18:1 与 C18:2 比例。

3. 代谢流推拉策略

·         前体供给强化：表达解脂耶氏酵母乙酰辅酶 A 羧化酶 YliACC1，提升丙二酰 - CoA（脂肪酸合成前体）含量；整合异源乙酰 - CoA 合成通路（XPK-PTA），增强碳源流向脂肪酸合成；敲除 β- 氧化关键基因 POX1，减少脂肪酸降解；

·         产物合成强化：敲除 TAG 脂酶基因 TGL3/4，减少 TAG 降解；过表达磷脂酸磷酸酶 PAH1 和二酰甘油酰基转移酶 DGA1，强化 TAG 合成；过表达甘油激酶 GUT1，提升甘油 - 3 - 磷酸（TAG 骨架前体）供应。

4. DGA1 定向进化与筛选

·         易错 PCR 构建 DGA1 随机突变库，通过荧光激活细胞分选（FACS）结合 BODIPY 505/515 染色（中性脂质标记），高通量筛选催化活性提升的突变体；

·         测序鉴定优势突变体（DGA1L275V），整合至工程菌株优化产物合成。

📈 研究结果

1.    仅融合 ER 信号肽的修饰型 LPAT 可锚定至 ER（TAG 合成核心位点），未修饰 LPAT 在细胞内分散分布，无法参与 TAG 合成；

2.    表达 mCrlPAAT1 的 HF-2 菌株效果最优 —— 总脂质中 C16:0 占比从 HF-0 的 10.38±0.45% 升至 20.38±4.25%，TAG 中 C16:0 占比从 15.84±0.18% 升至 21.54±0.14%，sn-2 位 C16:0 占比从 1.71±0.05% 升至 18.90±0.11%；

3.    HF-1~HF-3 均实现 OPO 从头合成，HF-2（mCrlPAAT1）的 OPO 占比最高（3.73±1.58%），HF-1（rmBnLPAT1）、HF-3（mCrlPAAT2）分别为 2.37±0.76%、2.15±0.25%，证明异源 LPAT 的 C16:0 底物偏好可定向引导酰基至 sn-2 位。

Fig3. 异源和天然LPAT联合表达对FA组成和OPO合成的影响

1.    随着内源 LPAT（SLC1、ALE1、LOA1，均偏好不饱和脂肪酸）逐步敲除，总脂质与 TAG 中不饱和脂肪酸（C16:1、C18:1）占比下降，饱和脂肪酸（C16:0、C18:0）占比上升。HF-8（ΔSLC1+ΔALE1+ΔLOA1+mCrlPAAT1）的 TAG 中 C16:0 占比从 HF-0 的 15.84±0.18% 升至 25.24±0.14%，C16:1 占比从 38.80±0.04% 降至 33.86±0.16%；

2.    HF-8 的 sn-2 位 C16:0 占比达 40%，TAG 中 C16:0 在 sn-2 位的酯化率超 50%，较 HF-0（3.60%）提升 13.9 倍；仅敲除内源 LPAT（无 mCrlPAAT1）的菌株，C16:0 提升幅度不足 HF-8 的 1/3，证明 “异源表达 + 内源敲除” 存在协同效应；

3.    HF-8 的 OPO 占总 TAG 比例达 7.00±0.18%，较未敲除内源 LPAT 的 HF-2（3.73%）提升 87.7%。

Fig4. GPAT 优化定向改善 TAG 酰基分布

1.    删除 ATS1 的叶绿体信号肽（mATS1）可实现胞内表达，叠加 ER 信号肽（rmATS1）可锚定至 ER，解决植物源 GPAT 在酵母中的定位难题；

2.    敲除内源偏好 C16:0 的 GPAT（SCT1）后，HF-9 的 TAG 中 C16:0 占比从 HF-8 的 25.24% 降至 18.39%，但 sn-2 位 C16:0 酯化率升至 > 78%；表达 rmATS1（偏好 C18:1-CoA）的 HF-10，TAG 中 C18:1 占比从 HF-9 的 24.34% 升至 30.45%，匹配 OPO“sn-1/3 位为不饱和脂肪酸” 的结构需求；

3.    HF-10 的 OPO 占总 TAG 比例达 8.2%，较 HF-9（无 rmATS1）提升 5.1%。

Fig5. 脂肪酸组成修饰实现OPO和 OPL 从头合成

1.    PgOLE1 是来自 P. graminis 的 Δ9 去饱和酶，底物偏好 C18：0。HF-11（PgOLE1 替换 OLE1）的总脂质中 C16:1 占比从 HF-10 的 45.18% 降至 32.08%，C18:1 占比从 39.71% 升至 47.40%；HF-12（叠加 MmELVOL6）的 C16:1 进一步降至 18.49%，C18:1 升至 61.73%，OPO 比例达 26.59%；

2.    HF-13（表达解脂耶氏酵母 FAD2）首次在酿酒酵母中实现 C18:2 合成，总脂质中 C18:2 占比达 31.22%，C18:1 降至 33.73%，成功构建 OPL 从头合成通路；

3.    HF-13 的 OPO 与 OPL 占总 TAG 比例分别为 19.12±2.74%、14.92±1.76%，证明脂肪酸组成修饰可同时满足两种 HMF 核心成分的合成需求。

Fig6：推拉策略强化 TAG 总产量

1.    表达 YliACC1 的 HF-15，TAG 产量达 23.51±2.61 mg/g DCW（较 HF-13 提升 42.3%）；整合 xpk-PTA 通路的 HF-19，TAG 产量进一步升至 27.30±3.87 mg/g DCW；

2.    敲除 TAG 脂酶 TGL3/4 的 HF-20~HF-21，TAG 产量较 HF-19 提升 15%-20%；过表达 PAH1（磷脂酸磷酸酶）与 DGA1（二酰甘油酰基转移酶）的 HF-24，TAG 产量达 73.60±0.74 mg/g DCW；

3.    过表达甘油激酶 GUT1（提升 TAG 骨架前体）的 HF-32，TAG 产量达 81.20±2.92 mg/g DCW（较 HF-19 提升 197.8%），且 OPO/OPL 滴度达 12.35 mg/L、5.84 mg/L。

Fig7：推拉策略强化 TAG 总产量

1.    通过易错 PCR 构建 DGA1 突变库，结合荧光激活细胞分选（FACS，BODIPY 染色），获得 MU-1 突变体，测序确认 DGA1 第 275 位亮氨酸→缬氨酸（DGA1L275V）；

2.    整合 DGA1L275V 的 HF-33，TAG 产量达 90.38±5.83 mg/g DCW，较未突变菌株 HF-30（25.17 mg/g DCW）提升 259.0%；

3.    HF-33 的 OPL 占总 TAG 比例达 17.08%，超过 OPO（11.18%），实现两种产物的高效协同合成。

Fig8：菌株HF-34/35在3L生物反应器放大验证

1.    34 h 进入稳定期（OD600=30.45）；44 h 停止葡萄糖补料（避免乙醇过度积累，此时乙醇浓度达峰值）；73 h DCW 达 9.9±0.26 g/L，细胞利用残留乙醇持续合成产物；

2.    73 h TAG 产量达 114.71±4.36 mg/g DCW，总 TAG 滴度 1.14±0.07 g/L；

3.    73 h OPO 与 OPL 滴度分别达 130.48 mg/L、88.35 mg/L，较摇瓶水平（HF-32 的 12.35 mg/L、5.84 mg/L）提升 10.6 倍、15.1 倍。

4.    HF-35 的细胞密度（OD600=20.85）低于 HF-34，但 TAG 产量（127.19 mg/g DCW）更高，证明 DGA1L275V 突变在放大培养中仍能维持高催化活性；

5.    HF-35 的 OPL 滴度（162.30 mg/L）显著高于 HF-34（88.35 mg/L），且为目前文献报道中 “以葡萄糖为唯一碳源” 的最高 OPL 产量。

总结

1.    重构 HMF 合成模块，通过异源表达 ER 定位的 C16:0 偏好型 LPAT + 敲除内源 LPAT，实现 sn-2 位 C16:0 酯化率超 70%；

2.    修饰脂肪酸组成，引入 FAD2 通路实现 OPL 从头合成，平衡 C18:1 与 C18:2 比例；

3.    结合推拉策略与 DGA1 定向进化，TAG 产量提升 3.86 倍，达 127.19 mg/g DCW；

4.    3-L 生物反应器中，OPO 和 OPL 最高滴定度分别达 130.48 mg/L 和 162.30 mg/g，为目前报道最高水平。