近日，Journal of Agricultural and Food Chemistry发表了江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室刘延峰研究员课题组的研究成果“ Ethanol-inducible Bioproduction of human α-lactalbumin in Komagataella phaffii ” (2025, 73, 15, 9246–9260)。2022级硕士生王昕毅为论文第一作者，刘延峰研究员为通讯作者。

母乳中的 α-乳白蛋白（α-LA）是婴儿生长发育的关键营养来源，但其大规模生产长期依赖动物提取，存在过敏风险且与人类蛋白差异显著。近年来，合成生物技术为解决这一难题提供了新途径，然而常用宿主毕赤酵母的传统甲醇诱导系统存在毒性高、工艺复杂、表达水平低等瓶颈。

为解决上述问题，本研究以毕赤酵母GS115为出发菌株，开展以下四方面研究：构建并强化人源α-LA的无甲醇表达系统；通过优化分泌信号肽结合多拷贝策略提升人源α-LA表达量；通过共表达表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）来源的聚磷酸激酶（SePPK）以消除分批补料发酵时的乙酸积累；通过优化培养条件缓解人源α-LA在发酵过程中的降解。本研究借助合成生物学工具，应用乙醇诱导转录信号放大装置（ESAD）表达人α-LA，将α-LA产量提升至甲醇表达系统的2.5倍。随后，通过逐步增加lacO拷贝数，得到含 5 个lacO的菌株（ESAD-5LA），产量达 10.00 mg/L，较单拷贝菌株提升 38%。接下来，本研究借助杂合信号肽策略，将 14 种不同来源的信号肽进行模块化拼接，优化 N 端信号识别区与 C 端加工区的组合，新设计的 P4 型信号肽使 α-LA 产量从 10 mg/L 提升至 12.68 mg/L，提升 26.8%。

在从摇瓶到3 L发酵罐的测试过程中，乙醇转化生成的乙酸在发酵液中快速堆积，严重抑制细胞活性。为此，本研究引入聚磷酸激酶（SePPK），通过补充六偏磷酸钠再生 ATP，为乙酸利用供能，减少乙酸积累。同时，将发酵液 pH 调至 3，抑制胞外蛋白酶对 α-LA 的降解。上述调控策略，乙酸积累被完全消除，目标蛋白产量达到 0.6 g/L。

该研究得到了国家自然科学基金和江苏省合成生物学基础研究中心（BK20233003）等项目的资助。

图1 在毕赤酵母中使用 ESAD 系统异源表达人源α-LA

图2 杂交信号肽对人源 α-LA 分泌和表达量的影响

图3 分离高产量多拷贝α-LA 生产菌株并在 3 L 生物反应器中进行补料分批发酵

图4 在 3 L生物反应器中共表达 SePPK 进行乙酸消耗，并优化补料分批发酵以生产 α-LA