铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种可引发肺炎、囊性纤维化、血流感染等多种疾病的机会致病菌，通常存在于人体皮肤、呼吸道和胃肠道。全世界约7.3%的人群被铜绿假单胞菌定植或感染，严重感染者的病死率高达37.5%。随着抗生素的广泛使用，铜绿假单胞菌的耐药性逐渐增强，已被世界卫生组织（WHO）列为重点关注的超级耐药菌之一。因此，开发安全、有效的铜绿假单胞菌疫苗成为保障人民生命健康的迫切需求。研究表明，铜绿假单胞菌表面脂多糖是重要的免疫表位，能够被人体免疫系统识别，是开发糖疫苗的关键靶标分子。

近期，江南大学生物工程学院、糖化学与生物技术教育部重点实验室、糖疫苗与糖药物江苏省高校重点实验室尹健教授团队报道了铜绿假单胞菌O4血清型脂多糖O-抗原四糖重复单元的合成工作，研究成果“Total Synthesis of the Tetrasaccharide Repeating Unit of Pseudomonas aeruginosa Serotype 4 O-Antigen”在线发表于Chinese Journal of Chemistry（中科院一区Top期刊，DOI: 10.1002/cjoc.70098）。

图1. 铜绿假单胞菌O4血清型脂多糖O-抗原四糖重复单元结构（来源：Chinese Journal of Chemistry）

铜绿假单胞菌主要包含20种血清分型，其中O4血清型占比为2.4%。该血清型脂多糖是八价铜绿假单胞菌脂多糖疫苗的重要组成成分，目前该疫苗已进入III期临床试验。因此，O4血清型脂多糖O-抗原四糖重复单元的合成对于开发铜绿假单胞菌合成糖结合物疫苗具有重要意义。O4血清型脂多糖O-抗原四糖重复单元的生物序列结构为[ɑ-L-Rha-(1→3)-ɑ-L-FucNAc-(1→3)-ɑ-L-FucNAc-(1→3)-ɑ-D-QuiNAc]（图1），其化学合成面临重大挑战。首先，四糖组成单元包含3个稀有氨基脱氧寡糖组成的1,2-顺式-糖苷键，即ɑ-D-乙酰氨基喹诺糖（ɑ-D-QuiNAc）和ɑ-L-乙酰氨基岩藻糖（ɑ-L-FucNAc）。由于它们的6号位为甲基，无法通过6位酰基的远程参与效应促进1,2-顺式-ɑ-糖苷键的构建。其次，虽然ɑ-L-FucNAc苷键可以通过在L-FucN₃砌块的4位羟基上修饰酰基来提高糖基化反应的ɑ立体选择性，但4位的酰基会降低L-FucN₃ 3位羟基的反应活性，影响后续非还原端糖链延伸的效率。因此，L-FucN₃4位羟基保护基的选择对四糖的合成至关重要。

图2. 四糖重复单元的逆合成分析（来源：Chinese Journal of Chemistry）

通过逆合成分析（图2），研究人员在L-鼠李糖（L-Rha）砌块的2位引入具有邻基参与效应的乙酰基作为羟基保护基，以确保高立体选择性构建1,2-反式L-Rha糖苷键。对于L-Fuc砌块和D-Quino砌块，其2位采用叠氮基保护，以避免糖基化反应过程中邻基参与效应导致1,2-反式-糖苷键的生成。L-FucN₃砌块4位羟基分别采用乙酰丙酰基（Lev）、乙酰基（Ac）和苯甲酰基（Bz）进行保护，系统评估了不同酰基对构建两个ɑ-L-FucN₃糖苷键选择性和效率的影响。研究表明，L-FucN₃砌块中羟基采用供电保护基，可以促进ɑ糖苷键的生成。因此，L-FucN₃砌块3位羟基采用2-奈亚甲（Nap）基保护。

图3. 单糖砌块的制备（来源：Chinese Journal of Chemistry）

构建四糖所需的单糖砌块3、4、5、6、7和10均以市售的鼠李糖、岩藻糖和葡萄糖为起始原料，经多步保护-脱保护基操作合成得到（图3）。制备得到所有单糖砌块后，研究人员进行还原端α-L-FucN₃-(1→3)-α-D-QuiNAc二糖的合成研究。首先使用4-O-Lev保护的L-FucN₃硒糖基供体4与D-QuiNAc受体7进行偶连，以乙醚和二氯甲烷为溶剂，在碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸的催化作用下，以63%的产率合成得到单一α构型二糖17（表1）。在相同的反应条件下，4-O-Ac保护的硒糖基供体5和4-O-Bz保护的硒糖基供体6分别与受体7进行糖基化反应，均高立体选择性合成得到ɑ构型二糖18和19，产率分别为61%和73%。结果表明，4-O-Bz保护的硒糖基供体与受体的糖基化反应效率优于4-O-Lev和4-O-Ac保护的硒糖基供体。进一步将硒糖基供体6转换成三氟乙酰亚胺酯供体16，在三氟甲磺酸三甲基硅脂（TMSOTf）的催化条件下与受体7偶连，生成二糖19的产率可提高至87%。

表1：二糖的合成研究

二糖19在2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌（DDQ）的条件下选择性脱除Nap，得到二糖受体20，产率为81%（图4）。在TMSOTf的催化作用下，受体20与L-FucN₃三氟乙酰亚胺酯基供体16发生糖基化反应，以71%的产率获得单一α构型的三糖21。随后，三糖21在DDQ的作用下脱除Nap基团，生成三糖受体22。接着，L-Rha硫糖基供体3与三糖受体22在碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸的催化下反应，制备得到四糖23，但产率仅为43%。产率低下的原因可能包括：三糖受体羟基邻位Bz为吸电子基团，降低了羟基的反应活性；以及糖链的延长导致的三糖受体羟基位阻增加，进一步抑制了四糖偶连的效率。为提升产率，研究人员将L-Rha硫糖基供体3转化为三氟乙酰亚胺酯基供体10，并在TMSOTf的催化下与三糖受体反应，产率提高至56%。然而，实验中观察到部分受体与TMS结合的副产物。因此，研究人员改用空间位阻更大的叔丁基二甲基三氟甲磺酸硅脂（TBSOTf）作为糖基化反应的促进剂，四糖23的合成效率进一步提高至68%。这一结果表明，三氟乙酰亚胺酯基供体在与低活性糖基受体反应时表现出更高的反应活性。随后，四糖23在硫代乙酸的作用下将N₃还原为NHAc，使用10%的NaOH和甲醇钠脱去四糖中的酰基。最终，半脱保护产物在钯碳加氢条件下脱除所有芳香基团，得到目标四糖1，三步反应总产率为72%。铜绿假单胞菌O4血清型脂多糖O-抗原四糖的成功构建，不仅为铜绿假单胞菌合成糖疫苗的开发提供物质基础，也为稀有脱氧氨基寡糖的合成提供了有效参考。

图4. 四糖的组装及脱保护（来源：Chinese Journal of Chemistry）

XiaopengZou, JunxiZhang, Yilei Lu, Guangzong Tian, Chunjun Qin, Jing Hu, Jian Yin.Total Synthesis of the Tetrasaccharide Repeating Unit of Pseudomonas aeruginosa Serotype 4 O-Antigen. Chinese Journal of Chemistry, 2025, 43, 2174-2180.

     尹健教授为该文章的通讯作者，邹小鹏助理研究员为第一作者。尹健教授团队针对铜绿假单胞菌开展了覆盖20个血清型的脂多糖抗原的合成及免疫活性研究，截止目前尹健教授团队已报道了O4、O5、O10、O11、O17、O19六个血清型脂多糖O-抗原重复单元的合成工作（图5），发展了基于保护基电子效应、远程参与效应和离去基团调控的高立体选择性糖基化方法，实现多种稀有氨基寡糖1,2-顺式-糖苷键的高效制备，构建了铜绿假单胞菌活性寡糖抗原库。同时，发展糖芯片技术，对合成的O-抗原糖链进行免疫活性分析，发现了有趣且重要的铜绿假单胞菌脂多糖关键抗原表位。其中，O5血清型O-抗原三糖重复片段被国际抗原表位数据库（IEDB）收录，这些研究为铜绿假单胞菌合成糖疫苗的开发提供重要的理论依据。目前，其余血清型脂多糖抗原的化学合成以及生物活性评价正在进行中。

图5. 铜绿假单胞菌糖脂多糖抗原的制备及活性研究（来源：Chinese Journal of Chemistry）

江南大学生物工程学院、糖化学与生物技术教育部重点实验室尹健教授课题组专注于“糖疫苗与药物工程”研究，负责人尹健教授从事糖科学研究20年，曾获得国家杰出青年科学基金项目和国家海外高层次人才青年项目；目前担任江南大学生命科学与健康工程学院院长，糖疫苗与糖药物江苏省高校重点实验室主任，江南大学疫苗工程创新研究中心主任。团队建立以来，主要致力于糖化学驱动的细菌糖疫苗的应用基础研究，聚焦已有糖疫苗的迭代升级和新型糖疫苗的创制。旨在通过发展糖链的化学工业合成技术和生物合成技术，融合糖芯片等医药化工前沿技术，推动糖链抗原的免疫表位解析、优选、改造和规模化制备。近年来，以通讯作者形式在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Sci. Adv.等发表论文60余篇，授权中国发明专利26件，美国发明专利11件。研究成果获得T. Ogawa Young Investigator Award、Thieme Chemistry Journals Award、“张树政糖科学奖-优秀青年奖”、“张天民糖类药物奖-杰出青年奖”、“惠永正糖科学奖-青年创新奖”等国内外学术奖项。