4月24日，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室史劲松团队在Journal of Agricultural and Food Chemistry（IF: 5.7）上在线发表了题为《Enhanced Biosynthesis of 6′-Sialyllactose in Escherichia coli via Systematic Metabolic Engineering》的研究文章。该研究通过系统的代谢工程技术，在大肠杆菌K12 MG1655中实现了6′-SL的高效生物合成，最终在5 L发酵罐中，经过76小时培养，6′-SL产量达到12.82 g/L。下面我们对这篇文章整理解读，供大家参考。

构建初始6′-SL生产菌株：通过CRISPR-Cas9系统敲除竞争性代谢途径基因（nanATEK、nagAB和lacZ），并引入两个关键酶（CMP-Neu5Ac合成酶NmCSS和α2,6-唾液转移酶Pd2,6ST）。初步摇瓶发酵实验中，6′-SL产量达到了0.98 g/L。

筛选不同来源酶及优化质粒表达组合：利用NCBI数据库针对利用NmCSS和Pd2, 6ST酶序列进行序列同源性分析，筛选出具有潜在高催化活性的酶 （来自Neisseria meningitidis的CMP-Neu5Ac 合成酶 NeuA（EC 2.7.7.43）和Pd2, 6ST），并构建不同的质粒组合进行测试。通过筛选和优化，将6′-SL产量提升至1.26 g/L。

启动子和RBS组合的优化：通过系统评估不同启动子和RBS组合对基因表达强度的影响，6′-SL产量达到2.41 g/L。

基于深度突变扫描的酶设计与改造：利用DeMaSK工具对关键酶NeuA和Pd2, 6ST进行氨基酸保守模式和突变频率分析，筛选出潜在的有益突变位点，并进行实验验证。通过单突变和组合突变，NeuA突变体S185T-I194V将6′-SL产量提升至3.67 g/L，结合Pd2, 6ST突变体160T，6′-SL产量最终达到4.27 g/L。

构建CTP再生循环池：通过建立CTP-ATP循环再生系统，优化细胞内CTP供应，ppK和cmK的共表达使6′-SL产量达到4.92 g/L，并且提升了底物利用率。

5 L发酵罐放大实验：在5L发酵罐中进行补料批培养，严格控制发酵参数，如温度、溶解氧和pH值，并采用间歇补料策略维持最佳底物可用性，经过76小时培养，6′-SL产量达到12.82 g/L，相较于初始摇瓶培养（0.98 g/L）提升了13倍。此外，在系统菌株优化过程中的中间代谢物分析显示细胞内积累显著减少：ManNAc从亲本菌株（BC-CP）的2.83 g/L下降到组合突变体的1.13 g/L，而Neu5Ac水平从2.97 g/L下降到0.81 g/L。这些发现证明了通过迭代代谢工程逐步提高中间体利用效率。

通过上述一系列系统的代谢工程策略，研究团队在大肠杆菌中实现了6′-SL的高效生物合成，产量提升至12.82 g/L，取得了重大突破。这些成果不仅展示了代谢工程在生物合成领域的强大潜力，也为未来相关研究提供了宝贵的参考和借鉴。