近期，实验室尹健教授团队在致病菌糖链抗原的全合成及抗原性研究方面取得新进展。研究成果“Chemical Synthesis and Antigenicity Evaluation ofShigella dysenteriaeSerotype 10 O‑Antigen Tetrasaccharide Containing a (S)‑4,6‑O‑Pyruvyl Ketal”发表于化学领域著名期刊Journal of the American Chemical Society（J. Am. Chem. Soc.https://doi.org/10.1021/jacs.2c05953）。

重症腹泻是五岁以下儿童的第二大致死原因。虽然过去的15年中儿童腹泻的死亡率降低了30%，发展中国家的发病率却仍很高。志贺氏菌是导致儿童重症腹泻的第二大致病菌，可分为痢疾志贺氏菌，福氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。鉴于志贺氏菌对于多种治疗中常用的抗生素已具有耐药性，世界卫生组织已将志贺氏菌疫苗研发作为公共健康主要的、并优先要考虑的项目。虽然基于全细胞，糖结合物和膜抗原通用模块的志贺氏菌疫苗候选物已进入临床试验阶段，仍无志贺氏菌疫苗成功上市。志贺氏菌O-抗原的蛋白结合物是最为领先的疫苗候选物。由于多糖提取过程中存在关键表位改变和不稳定性取代基缺失的问题，结构明确的合成寡糖已在糖结合疫苗开发领域发挥重要作用。Pozsgay等将化学合成的痢疾志贺氏菌1型O-抗原寡糖缀合于载体蛋白，所得合成寡糖结合物在三期临床试验中表现出比提取O-抗原所制备结合物更强的免疫活性。Mulard等将化学合成的痢疾志贺氏菌2a型O-抗原十五糖结合于载体蛋白，所得合成寡糖结合物在一期临床试验中为成年人提供了超过一年的免疫保护。目前，这一合成寡糖结合物候选疫苗已开展二期临床试验。

尹健教授团队一直致力于通过化学合成驱动糖疫苗的研究与创制，研究重点包括胃癌相关致病菌幽门螺旋杆菌糖链抗原、致病菌表面特有的多修饰糖链等。围绕幽门螺旋杆菌糖链抗原，先后完成外核心八糖、核心十一糖、O2血清型O-抗原六糖、O6血清型O-抗原十三糖的化学合成及抗原性研究（J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 14535；Chem. Eur. J., 2018, 24, 2868；Chem. Commun., 2020, 56, 344；Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59, 13362）。围绕致病菌表面特有的多修饰糖链，关注各种稀有修饰基团的化学合成方法发展，及其在糖链免疫活性中所起作用，已完成乙脒基、3-羟基丁酰胺基、磷酸酯基、羧酰氨基等稀有基团的选择性组装研究（J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 3120；Chin. J. Nat. Medicines, 2020, 18, 628；Chin. J. Nat. Medicines, 2022, 20, 401）。化学合成所得的致病菌多修饰糖链片段结构及其类似物将促进细菌糖链抗原免疫活性的解析。

痢疾志贺氏菌10血清型O-抗原由四糖重复单元[→2)-β-D-Manp4,6(S)Pyr-(1→3)-α-D-ManpNAc-(1→3)-β-L-Rhap-(1→4)-α-D-GlcpNAc-(1→]组成（图1），其中D-甘露糖修饰有(S)-4,6-O-丙酮酸缩酮基。发展痢疾志贺氏菌10型O-抗原寡糖的化学合成方法、并将合成寡糖应用于生物医药研究，将为明确这一结构特异性糖链的免疫活性构效关系提供基础。该四糖结构中含有三个1,2-顺式-糖苷键，包括一个β-D-甘露糖苷键、一个β-L-鼠李糖苷键和一个α-D-氨基葡萄糖苷键，其化学合成具有很大挑战性。

图1.痢疾志贺氏菌10血清型O-抗原

尹健教授团队利用1,2-反式-β-糖基化&C2构型翻转策略，实现β-L-鼠李糖苷键的专一性构建。利用1,2-反式-β-糖基化&C2构型翻转策略合成β-D-甘露糖苷键时，发现4,6-O-丙酮酸缩酮基起不利影响，而含4,6-O-苯甲缩醛基的葡萄糖苷二糖则可经Swern氧化&还原完成C2构型翻转。利用构象锁定策略合成β-D-甘露糖苷键时，发现4,6-O-苯甲缩醛基和4,6-O-丙酮酸缩酮基均可介导专一性β-D-甘露糖基化。然而，4,6-O-丙酮酸缩酮基供体的糖基化反应产率显著低于4,6-O-苯甲缩醛基供体的糖基化产率。因此，决定在四糖阶段开展4,6-O-丙酮酸缩酮基的组装，以避免其对四糖合成整体效率的不利影响。四糖组装过程中，发现二糖供体和二糖受体的反应活性均受糖环取代基的影响，通过增加供电子性的苄基数量，显著提高了糖基化产率。尤其是将二糖受体中一个2-乙酰氨基转变为2-苄基乙酰氨基，有效提高了另一糖环上羟基的亲核性。进一步组装(S)-4,6-O-丙酮酸缩酮基后，经全脱保护完成了目标四糖的首次全合成。

在糖基受体中增加供电子性保护基可以提高糖基受体反应活性已被熟知，但是其理论机制并未充分理清。尹健教授团队基于具有不同反应活性的3个二糖受体13，34和35，利用量子化学计算探究了糖基受体活性调控的理论机制（图2）。首先，计算得到了糖基受体的优势构象，发现不同活性的糖基受体优势构象无显著差异。鉴于糖基受体的羟基需亲核进攻糖基供体，通过轨道权重福井函数和双描述符对不同糖基受体羟基的亲核性进行定量分析，可直观的呈现出高活性糖基受体是亲核性占主导，而低活性受体则有较高比例的亲电性。为了进一步定量比较不同分子羟基的亲核性，引入软度参数与福井函数（f_w^-）结合，从而更准确地定量分析不同分子间亲核性的差异。

图2.糖基受体的轨道权重福井函数和双描述符分析

此外，进一步制备了(R)-4,6-O-丙酮酸缩酮基四糖，无丙酮酸缩酮基四糖等糖链片段（图3）。利用糖芯片技术，以痢疾志贺氏菌抗血清对合成寡糖的抗原性进行分析。发现该四糖单元为痢疾志贺氏菌10型O-抗原的有效抗原表位，且(S)-4,6-O-丙酮酸缩酮基是关键结构因子。本研究结果为痢疾志贺氏菌10型O-抗原的疫苗研发提供了理论基础。此外，本研究首次对糖链中S和R构型丙酮酸缩酮基的生物活性作直接比较，并发现有价值的信息，将为细菌糖链中丙酮酸缩酮基等稀有修饰基团的活性研究提供参考。

图3.痢疾志贺氏菌10型O-抗原寡糖的抗原性分析

尹健教授为论文的通讯作者，青年教师秦春君为论文第一作者，博士生李玲昕和青年教师田光宗为论文的共同第一作者。上述研究得到了国家自然科学基金，中国博士后科学基金，江苏省自然科学基金的资助。研究团队特别感谢江南大学食品科学与技术国家重点实验室顾小红老师、江南大学生物工程学院刘海丽老师对本研究的支持。