近日，Biosensors and Bioelectronics在线发表了江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授课题组的研究成果“Directed evolution of diacetylchitobiose deacetylase via high-throughput droplet sorting with a novel, bacteria-based biosensor” (Biosensors and Bioelectronics. 2023. 219: 114818.)。2020级博士后孙国运为论文第一作者，刘龙教授为论文通讯作者。高通量细胞筛选是合成生物学、临床研究、药物开发等领域不可或缺的技术。目前主流的高通量筛选方法是流式细胞术，该技术可以实现超高通量的细胞筛选，但待筛选细胞共处一个液体环境，限制了对胞外分泌物的分析筛选。液滴微流体技术可以通过液滴包裹为细胞提供独立的化学环境，进而对胞外分泌物进行分析，从而实现细胞的高通量筛选。但是，液滴自身的油包水环境和过小的体积（几十皮升）使得在液滴内检测细胞代谢物十分困难。为解决上述难题，本研究构建了一种细菌生物传感器，将其与液滴微流体高通量筛选技术相结合，并以定向进化己丁二糖脱乙酰酶（Dac）为例，对该筛选系统的性能进行了验证。Dac是绿色生产氨基葡萄糖（GlcN）的关键酶，但其存在表达难、酶活低等问题，且目前没有合适的高通量筛选方法对其进行高效筛选。通过结合生物传感器，本研究实现了液滴内Dac酶活的检测，并结合定向进化显著提升了Dac的酶活（图1）。首先，通过基因回路设计构建了一种可以在细胞水平检测GlcN浓度的生物传感器（标记为“检测菌”），该生物传感器可以在液滴内通过荧光（绿色荧光蛋白）响应GlcN的浓度，其荧光表达强度与GlcN浓度呈正相关关系，从而指示胞外的Dac酶活水平。在孔板体系下验证了检测菌对GlcN的荧光响应，证实了其可在适当范围内（0-1.5 g/L）检测GlcN，且不会被底物乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）干扰；同时，针对Dac酶活不同的产酶菌（M0-无酶活、M1-低酶活、M2-高酶活），检测菌可以通过荧光表达正确检测出产酶菌酶活的高低（图2）。同样的荧光响应验证和酶活水平验证实验也在液滴体系中得以实现，验证了液滴高通量筛选系统的可行性（图3）。随后，利用建立的高通量筛选系统对含有不同Dac突变体（由易错PCR构建）的产酶菌进行了3小时筛选，共筛选了约20万个突变体；经复筛验证，得到了最佳的突变体M7，其酶活由突变前的27.2 ± 1.8 U/mL（M2）提升至48.6 ± 1.5 U/mL（图4）。与M2相比，M7展现出更高的催化速率；根据突变位点分析，M7在R157T的基础上增加了S60I和F168S突变点，有利于酶活的提升（图5）。上述研究工作得到了国家重点研发项目（2018YFA0900504，2018YFA0900300）、国家自然科学基金（31930085，32021005，31870069）、中央高校基本科研专项资金（JUSRP221013，JUSRP121010，JUSRP52019A）等项目的资助。

图1 结合生物传感器与液滴高通量筛选定向进化Dac示意图

图2 孔板体系检测菌响应GlcN与Dac酶活检测

图3液滴体系检测菌响应GlcN与Dac酶活检测

图4 筛选阈值设定与酶活水平检测

图5 最佳Dac突变M7与突变前（M2）的比较