植物来源的生物碱是一类重要的药物。然而，其获取方式仍然依赖植物提取，难以满足当前市场需求。多酶级联反应作为一种高效的生产方式，正在革新天然产物的生物制造。因此，为了解决微生物合成生物碱的难题，本研究借助于酶挖掘和酶工程手段构建了一个能够利用简单易得的底物合成天然的和非天然的苯乙基异喹啉生物碱(Phenethylisoquinoline alkaloids, PEIAs)的人工简短酶级联反应系统。更重要的是，通过“即插即用”策略替换该系统中的限速酶，本文实现了秋水仙碱前体(S)-autumnaline的高效合成与放大制备。这项研究不仅简化了未来秋水仙碱生物合成的步骤，还为通过多酶级联反应合成其他生物碱提供了范例。 

首先，本文作者对秋水仙碱前体(S)-autumnaline的合成路径进行逆向合成分析，设计了一个合成(S)-autumnaline及其衍生物的多酶级联反应新途径(Fig. 1)。该人工简短合成途径如Fig. 1c所示，底物多巴胺和苯丙醛衍生物在去甲乌药碱合酶(norcoclaurine synthase, NCS)作用下合成PEIA骨架，随后在氧甲基转移酶(O-methyltransferase, OMT)和氮甲基转移酶(N-methyltransferase, NMT)的参与下合成终产物(S)-autumnaline及其衍生物。因此，(S)-autumnaline及其衍生物的合成路径分为两个模块，PEIA骨架模块和甲基转移(Methyltransfer, MT)模块。考虑到底物苯丙醛衍生物在微生物体系中不稳定易被还原成醇，作者引入羧酸还原酶(Carboxylic acid reductase, CAR)将苯丙酸衍生物还原成相应的醛。该级联反应系统较天然合成路径的优势在于更短的合成途径且避免了P450(CYP75A109)催化的两步羟化反应。

Fig. 1.Design of an artificially concise multi-enzyme cascade for the biosynthesis of PEIAs.

接下来，作者以3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙酸作为模式底物测试多酶级联反应的可行性。并通过文献调研、酶筛选及酶工程等策略构建了PEIA骨架模块和MT模块，实现了产物(S)-1d的合成(Fig. 2)。

Fig. 2. Establishment of a multi-enzyme cascade reaction to efficiently synthesize (S)-autumnaline derivatives in vitro.

随后，作者将PEIA骨架模块和MT模块引入到大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)。同时，为了消除大肠杆菌内源酶参与中间体1a的消耗，作者敲除了大肠杆菌中7个内源基因，构建了工程菌株IAA，进而提高了中间体(S)-1b的产量。同时，作者将MT模块引入到IAA，最终通过一锅三步法实现了产物(S)-1d的合成，产量为3.09 mM (Fig. 3)。

Fig. 3.Biosynthesis of (S)-1d in engineered strain IAA.

为了评估上述人工酶级联反应系统合成(S)-autumnaline及其他PEIA的能力，作者对该系统的底物谱进行了拓展。结果表明，大部分的底物都能很好的转化为相应的终产物。然而，对于底物12，产物(S)-12d产率仅为19%，其主要原因是RnCOMT的活性不足限制了底物(S)-12b的转化 (Fig. 4)。因此，作者选择了植物体内催化该步反应的氧甲基转移酶(GsOMT1)，并通过添加可溶性标签和酶分子理性改造策略提高GsOMT1的催化能力（Fig. 5）。最后，在300 mL体系内大规模制备秋水仙碱生物合成前体(S)-autumnaline ((S)-12d)，使其产量达到了709 mg/L。

Fig. 4.Biosynthesis of (S)-autumnaline and its derivatives through the artificial multi-enzyme cascade reaction in a one-pot three-step process.

Fig. 5. Rational design of GsOMT1 for efficient biosynthesis of (S)-autumnaline.

上述工作发表于Nature Commun，江南大学2019级博士生高跃，2022级博士生李菲和罗正山副研究员为共同第一作者，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室饶义剑教授为通讯作者。上述工作得到了国家重点研发计划(2018YFA0901700)，国家自然科学基金(32270082, 22108122)，江苏省自然科学基金(BK20202002)和江苏省研究生科研与实践创新项目(KYCX20_1814)资助。

近年来饶义剑教授团队围绕“天然产物的途径解析和仿生定向合成与应用”开展了系统性的研究，并取得了一系列原创性研究成果，部分成果已发表在Nature Communications (2023，2024)、 Angew (2022, 2023)、 ACS Catalysis (2020，2021，2022，2024)、 Green Chemistry (2019, 2022)、 Water Research (2022)、 Journal of Hazardous Materials (2021, 2023)、 Chemical Engineering Journal (2021)等本领域权威期刊。