2023年4月，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙团队于国际期刊Bioresource Technology发表研究论文Combinatorial metabolic engineering enables the efficient production of ursolic acid and oleanolic acid in Saccharomyces cerevisiae。该研究通过表达和优化异源酶、增加胞质乙酰CoA水平、调整ERG1和CrAS的拷贝数来重新定向代谢，配合CrAO和AtCPR1脂滴定位及强化NADPH再生系统，将3L发酵罐中熊果酸(UA)和齐墩果酸(OA)滴度提高至1132.9和433.9mg/L。江南大学Ke Jin为该论文第一作者，江南大学刘龙为该论文的通讯作者。

UA和OA是广泛存在于多种植物中的五环三萜类化合物，因其在药理学中的治疗潜力而引起了广泛关注（具有抗致癌、抗氧化、抗炎和抗菌作用）。然而，UA和OA的植物提取效率低、耗时且费力。利用微生物作为生物催化剂，通过引入多个酶级联反应来生产高附加值产品已成为获取这些化合物的一种有前途的方法，可以用于合成UA和OA。

基于此背景，该研究通过异源表达CrAS以及CrAO和AtCPR1，实现了UA和OA的从头合成。随后，通过抑制乙酰CoA竞争途径、增强乙醇消耗途径增加胞内乙酰CoA含量并提高UA和OA的产量。进一步通过优化ERG1和CrAS的拷贝数、下调ERG7的表达水平以重定向代谢通量，此外，通过脂滴区室化消除CrAS、CrAO和AtCPR1之间的隔离，并加强了NADPH的再生系统，进一步提升了UA和OA的产量。最终菌株在3L发酵罐中生产出1132.9 mg/L UA和433.9 mg/L OA，为构建高效萜类化合物合成细胞工厂提供了新的方向。

通过优化细胞色素P450酶和CPR组合来提高UA和OA滴度

为了合成UA和OA，首先将来自C. roseus的多功能CrAS整合到酿酒酵母S6的基因组中，以合成前体α-和β-香树脂醇。在所得菌株UO1中检测到20.2 mg/L α- 香树脂醇和8.3 mg/L的β-香树脂醇。接下来，将来自C. roses的CrAO和来自A. thaliana的AtCPR1整合到UO1基因组中，得到菌株UO2，成功合成了7.4 mg/L的UA和3.0 mg/L的OA。此外，还验证了其他CPR与CrAO组合的效果，然而表达其他CPR的工程菌株产量比UO2更低。因此，选择AtCPR1进行进一步研究。

图1  酿酒酵母中UA和OA的生物合成

改造乙酰CoA库以增强UA和OA的生物合成

乙酰辅酶A作为MVA途径的中心代谢物，是五环三萜类化合物的关键前体。为了进一步提高UA和OA的产量，将参与乙醛酸分流的胞质苹果酸合酶(由MLS1编码)和过氧化物酶体柠檬酸合酶(由CIT2编码)分别敲除，抑制乙酰CoA竞争途径，得到菌株UO6和UO7。菌株UO6合成了31.7 mg/L的UA和16.70 mg/L的OA，分别是菌株UO2的4.3倍和5.9倍，表明乙酰辅酶A缺乏是UA和OA滴度提高的关键限速因素。而敲除CIT2并未带来产量的提升。作者进一步通过加强乙醇代谢途径提高乙酰CoA的含量：ADH2过表达使UA和OA滴度增加120%和101%。然而，菌株的生长量降低，这可能是由于乙酸积累。因此，作者将ALD6与ACS1/2同时过表达，用于解决由乙酸积累引起的细胞生长抑制。发酵结果显示，ACS1过表达对UA和OA生物合成的贡献更大，滴度增加到115.4 mg/L和49.3 mg/L，而ACS2过表达仅使UA和OA的产量分别增加到99.2 和42.1 mg/L，产量增加有限。

图2  通过提高乙酰CoA库来增加UA和OA的滴度

改变代谢通量增强UA和OA的生物合成

为了进一步引导代谢通量以最大限度地提高UA和OA的产量，作者对其生物合成途径中关键酶的拷贝数进行了优化。首先将ERG1整合到菌株UO9的基因组中，提高2,3-氧化角鲨烯的上游途径通量，得到的菌株UO11中产生的UA和OA分别增加到188.5 和64.0 mg/L，同时角鲨烯的滴度从2.3 g/L降至1.9 g/L。同时，进一步增加ERG1的拷贝数并未带来的产量提高有限，于是作者着手优化下游途径。2,3-氧化角鲨烯环化是UA和OA生物合成中的另一个限速步骤，作者对CrAS的拷贝数进行了优化。当CrAS的拷贝数达到三个时，UA和OA滴度达到最大值，分别达到455.2 mg/L和151.7 mg/L，角鲨烯滴度下降至1.30 g/L。

随后，作者通过降低主要分支途径麦角固醇合成的通量提高UA和OA的合成。由于麦角固醇合成对细胞生长必不可缺，作者通过将P_ERG7替换为高浓度葡萄糖诱导的启动子P_HXT1，目的是在诱导前合成足以供细胞生长的固醇。然而，UA和OA滴度仅略有增加，分别达到483.4 mg/L和163.8 mg/L。

图3  改变代谢通量增强UA和OA的生物合成

利用脂滴对UA和OA的生物合成途径进行区室化分隔

作者通过桥接荧光蛋白鉴定了UA和OA合成的途径酶的亚细胞定位，结果证明了参与UA和OA生物合成的催化酶存在一定隔离。为了缩短途径酶的距离，作者随后使用脂滴区隔化策略试图消除关键酶之间的隔离。将脂滴膜蛋白PLN1融合到CrAO-AtCPR1的N端进行脂滴靶向，将该融合蛋白整合到UO16基因组中，得到菌株UO18，UA和OA滴度分别提高到621.2 mg/L和209.8 mg/L。结果表明，区隔策略有效地整合了天然隔离酶，并提高了UA和OA的产量。

图4  参与UA和OA生物合成途径的关键酶的脂滴区隔化策略

辅因子优化对UA和OA生物合成的影响

MVA途径中的许多酶，如tHMG1、ERG9和ERG1，都依赖辅因子NADPH。此外，细胞色素P450酶的活性与NADPH再生酶可以协同提高。作者首先检测了NADPH/NADP+比值，结果表明，在引入了外源酶后，NADPH和NADP+之间存在不平衡。于是作者通过过表达ZWF1和POS5提高NADPH的再生。过表达ZWF1和POS5都能在一定程度上提高了NADPH/NADP+比值，但过表达ZWF1降低了细胞生长，降低了UA和OA滴度。而P_GAL7控制下POS5过表达使UA和OA滴度分别提高到692.3和253.4 mg/L。

图5  增强NADPH供应对UA和OA生物合成的影响

通过分批补料发酵生产UA和OA

在3-L发酵罐中培养工程菌株UO19，评价其UA和OA的产量。最终最高滴度为1132.9 mg/L的UA和433.9 mg/L的OA。

图6  菌株UO19在3-L发酵罐中高密度发酵生产UA和OA

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https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0960852423002456?via%3Dihub