绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种引发囊性纤维化、血流感染、尿路感染、医院获得性肺炎等疾病的革兰氏阴性菌，致死率为5.3%。2017年，世界卫生组织（WHO）将绿脓杆菌列为12种超级耐药菌之一。在我国，绿脓杆菌对亚胺培南（imipenem）和美罗培南（meropenem）的耐药率分别高达22.1%和17.6%。开发安全、有效的绿脓杆菌疫苗已成为保障人民生命健康的重要需求。研究表明，绿脓杆菌表面脂多糖链是重要的免疫表位，可被人体免疫系统识别，是绿脓杆菌糖疫苗开发的靶标分子。近期，江南大学生物工程学院、糖化学与生物技术教育部重点实验室、糖疫苗与糖药物江苏省高校重点实验室尹健教授团队报道了O10和O19型绿脓杆菌脂多糖O-抗原三糖重复单元的合成研究工作，研究成果“Chemical Synthesis of Conjugation-ready Trisaccharides Corre-sponding to Biological Repeating Units of Pseudomonas aeruginosa Serotype 10 and 19 O-Antigens”在线发表于Organic Letters（doi.org/10.1021/acs.orglett.4c03167）。

图1. O10和O19型绿脓杆菌脂多糖O-抗原三糖重复单元结构

    O19型绿脓杆菌脂多糖O-抗原三糖重复单元的生物序列结构为[→3)-a-L-Rhap-(1→4)-α-L-GalpNAcA-(1→3)-α-D-QuipNAc-(1→]（图1），末端α-D-QuipNAc糖单元与脂多糖核心结构相连接。O10型绿脓杆菌脂多糖O-抗原三糖重复单元与O19型相似，其α-L-Rhap单元中含有一个2-OAc。因此，通过一条合成路线可同时制备O10和O19型2种三糖抗原。O10和O19型脂多糖O-抗原三糖合成具有非常大的挑战性。首先，三糖组成单元中含有2个1,2-顺式连接稀有氨基脱氧寡糖，即α-L-GalpNAcA和α-D-QuipNAc。它们C6位均无羟基，无法利用酰基远程参与作用帮助形成α-糖苷键。其次，L-GalpNAcA砌块处于三糖中间位置，糖醛酸作为供体或受体活性相对较低，影响糖基化反应的效率。此外，目前关于L-GalpNAcA糖基化研究报道较少，可借鉴的实验数据和经验有限。最后，三糖中含有乙酰基、氨基、乙酰氨基、羧基等官能团，它们之间的正交保护相互影响。

图2. 三糖重复单元结构的逆合成分析

    L-GalpNAcA砌块的保护基设计及氧化时机的选择对三糖的合成至关重要。如果在单糖中先对L-半乳糖氨砌块进行氧化，可能导致糖基化反应α-立体选择性差；而如果在三糖组装完成后再对L-半乳糖氨C6-OH进行氧化，则可能由于空间位阻，导致C6位羟基氧化效率低，甚至无法实现氧化。因此，研究人员设计了L-半乳糖砌块6（图2）：其2位采用叠氮基保护，避免了糖基化过程中的邻基基团的参与效应形成â糖苷键；3位采用供电子基苄基保护，提高L-半乳糖氨C4位羟基的反应活性；4,6位采用苄叉基保护，利用苄叉基的环构象锁定效应，增加L-半乳糖氨糖基化反应的α-立体选择性。D-QuipNAc砌块的2位同样采用叠氮基保护，并通过TMSI和Ph₃P=O介导的糖基化反应，实现了D-QuipN₃与氨基连接臂之间的高立体选择性糖基化反应（α/â=10:1）（图3）。

图3. D-QuipN₃a-糖苷键的构建

    通过L-GalpN₃供体和D-QuipNAc受体制备二糖16时，研究人员发现L-GalN₃砌块4,6-苄叉基的环构象锁定效应有效促进了L-GalpN₃α-糖苷键的生成。无论是使用硒苯基供体6还是苯基三氟亚胺酯基供体11与受体7反应，均可得到α单一构型的二糖16。然而，苯基三氟亚胺酯基供体与受体反应生成二糖的效率明显高于硒苯基供体6与受体反应的效率（表1）。

表1. 二糖16的合成研究

合成得到二糖16后，将4,6-苄叉基脱除。研究人员选择在二糖上将L-GalpN₃单元的C6-OH进行氧化，高效的制备得到二糖受体4。低活性的糖醛酸二糖受体C4-OH与L-Rha鼠李糖5进行糖基化反应。研究人员发现，降低反应温度，可以促进三糖3的组装效率。三糖3在AcSH的作用下将叠氮基还原为乙酰氨基，在Pd/C和H₂的作用下脱除结构中的芳香基团，高效合成得到化合物1。三糖1在碱性条件下脱去乙酰基，制备得到三糖化合物2。三糖1和2还原端均含有五碳氨基连接臂，为后续糖芯片和糖缀合物活性研究作准备。本研究成果可为复杂稀有氨基寡糖的合成提供有效的参考和借鉴。

    尹健教授为论文的通讯作者，邹小鹏助理研究员为论文第一作者。尹健教授团队一直致力于糖疫苗工程的研究，聚焦已有糖疫苗的迭代升级和新型糖疫苗的创制。旨在通过发展糖链的化学工业合成技术和生物合成技术，融合糖芯片等医药化工前沿技术，推动糖链抗原的免疫表位解析、优选、改造和规模化制备。上述研究得到了国家自然科学基金（22277042, 22207042, 22325803），国家重点研发计划（2023YFC2308000）的资助。研究团队特别感谢江南大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室顾小红老师对本研究的支持。

[ 论文信息 ]https://doi.org/10.1021/acs.orglett.4c03167Xiaopeng Zou, Chunjun Qin, Guangzong Tian, Junxi Zhang, Jing Hu, Jian Yin. Chemical Synthesis of Conjugation-ready Trisaccharides Corresponding to Biological Repeating Units of Pseudomonas aeruginosa Serotype 10 and 19 O-Antigens. Organic Letters, 2024, doi.org/10.1021/acs.orglett.4c03167.