近日，Biotechnology Advances在线发表了江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授课题组的综述论文“CRISPR genetic toolkits of classical food microorganisms: Current state and future prospects”(Lv et al., 2023, Biotechnol. Adv., 69: 108261)。吕雪芹副研究员为论文第一作者，刘龙教授为论文通讯作者。

近年来，随着代谢工程和合成生物学的快速发展，通过构建微生物细胞工厂，已经实现了多种功能性食品配料的制备，然而，传统的细胞工厂的构建往往依赖于人工选择或自然突变，这种方式改变菌株特性的效率低、稳定性差，且耗时长。因此，开发快速、高效、精准的基因编辑工具用于快速获取高效微生物细胞工厂，特别是食品微生物细胞工厂已引起研究者的广泛关注。

CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins)是继ZFNs (Zinc-finger nucleases)和TALENs (Transcription activator-like effector nucleases)后的第三代基因编辑技术，以其多样性、模块化和高效性为食品中微生物的功能拓展甚至整个食品制造领域带来了极大的创新。基于CRISPR-Cas的基因编辑工具箱不仅可以进行基因组改造，实现高效的单点、多点甚至整个基因组的编辑功能；还可以通过nickase或者dead Cas蛋白(nCas或dCas)和特定的蛋白结构域，如逆转录酶、脱氨酶和转录激活因子结合，构建先导编辑器(Primer Editor)、碱基编辑器（Base Editor）CRISPR activation/interference (CRISPRa/i)等工具箱，实现更为多样和精准的基因编辑和代谢调控与重编程。

为了更好地理解和促进CRISPR-Cas基因编辑工具箱在代谢工程领域的应用与发展，该综述以乳酸菌(LAB)、谷氨棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为例，系统介绍了基于CRISPR-Cas系统的基因编辑和代谢调控工具箱在食品微生物菌株中的构建、优化和应用。首先，系统地介绍与分析了在上述四种食品微生物菌株中，CRISPR-Cas基因编辑工具箱从单基因编辑到多基因编辑再到基因组规模的逐级开发与优化；其次，详细论述了碱基编辑、先导编辑等精准基因编辑工具箱的研究与应用；随后，分析和讨论了用于代谢调控和重编程的CRISPRa/i (CRISPR activation/interference)和CRISPR基因回路工具箱的开发及应用；最后，讨论了目前基因编辑工具箱在开发过程中存在的困难与挑战，并提出了可能的解决策略与方案。

相关研究图示

       上述研究得到了国家自然科学基金(22278186, 32270096)、中央高校基本科研专项资金(JUSRP222007, JUSRP622004)和江苏省研究生科研实践创新项目(1012050205238420)等项目的资助。