摘要枯草芽孢杆菌因其GRAS安全认证、无内毒素、蛋白分泌能力强等优势，已成为工业生物技术中的重要底盘细胞。然而，其基因表达调控工具箱在工业放大场景下仍显不足。当前广泛使用的IPTG及脱水四环素（aTc）诱导系统虽可实现快速强诱导，但存在诱导剂价格高昂、对宿主代谢产生毒性、大体积发酵中混合不均及泄漏表达等固有限制。此外，基于代谢物响应的生物传感器（如GlcN6P-CRISPRi系统）虽能实现自主调控，但其适用性受限于特定代谢中间体，通用性较差。现有基于碳水化合物的诱导启动子（如PmalA、PxylA等）虽具备内源性优势，但普遍存在输出强度不足、与葡萄糖培养基不兼容（受CCR抑制）及泄漏表达较高等问题，尚未形成系统化的工业级表达框架。因此，开发一套基于低成本、无毒性、可代谢诱导剂，且具备可编程自动诱导能力的高性能表达系统，对推动枯草芽孢杆菌在工业生物制造中的应用具有重要意义。本研究提出的MICA系统旨在通过整合内源碳源感应回路、转录放大机制及代谢开关逻辑，构建一个模块化、可扩展的诱导表达架构，以满足大规模生物过程对安全性、经济性及调控精度的综合需求。

简介在枯草芽孢杆菌中，现已构建多种可诱导表达系统，用于科研与工业生产。应用广泛的IPTG响应型启动子与四环素响应型启动子能够实现高效、快速的诱导表达，但这类系统通常需要价格较高的诱导剂，诱导时间需要精准把控，且普遍存在本底泄漏表达问题，在毒性蛋白的合成过程中该缺陷尤为突出。除上述化学诱导系统外，科研人员还开发了代谢物响应调控回路，可依据胞内代谢状态实现自主调控。典型代表为6‑磷酸葡萄糖响应型生物传感器，该传感器与成簇的规律间隔短回文重复序列干扰系统相偶联。此类系统可实现自我调节，但其性能受限于感应代谢物的特异性，因此仅适用于直接涉及该代谢中间物的代谢通路。另一类系统以糖类诱导型启动子为基础，例如，甘露糖诱导的PmanP系统可高效合成蛋白，但在复杂代谢工程场景下应用受限，而麦芽糖诱导启动子（如PmalA）现已完成优化，市场已经形成相应的商业化表达系统，是糖类启动子里表达效果最佳的启动子。本研究构建了基于可代谢诱导物的碳源自动诱导（MICA）系统，该统一型诱导表达构架以枯草芽孢杆菌内源可代谢碳源响应模块为基础。研究首先搭建启动子优化模块，提升诱导表达强度、降低本底泄漏，并对6套内源系统的调控参数进行定量解析。随后引入基于T7 RNA聚合酶的放大模块，进一步提升最大转录输出、提高诱导灵敏度，同时降低诱导剂用量。最后，利用葡萄糖介导的碳代谢阻遏效应（CCR）原理，在麦芽糖与甘露糖两套表达平台中构建动态代谢开关，无需外界人为干预，仅依靠主碳源的消耗，即可让系统在最佳时机自动启动表达阶段。将搭建完成的MICA体系用于碱性蛋白酶与β‑1,3‑葡聚糖酶的高效合成，同时实现番茄红素和β‑胡萝卜素生物合成的动态调控。综上，本研究建立了一套模块化、可调控、低成本的诱导表达平台，可为枯草芽孢杆菌的高效蛋白生产以及规模化代谢工程研究提供支撑。

图1.枯草芽孢杆菌中MICA系统的四模块架构：启动子优化、T7放大、自动诱导、输出应用。

研究过程内源碳源响应启动子的系统性工程化

在枯草芽孢杆菌中，研究团队首先评估了六种可代谢碳源（麦芽糖、甘露糖、山梨醇、阿拉伯糖、木糖、甘油）对枯草芽孢杆菌G600生长的剂量效应，确认其在过量条件下均能促进细胞增殖，具备作为诱导剂与辅助碳源的双重功能。随后，针对各碳源对应的天然启动子进行了定向进化与理性设计：

麦芽糖系统（PmalA）：通过突变cre位点（CG→AT，生成PmalA1）、缩短operator（malO）与核心启动子（-35/-10区）间距（生成PmalA2），以及修饰malO结合序列（生成PmalA3），系统解析了空间构象与转录激活蛋白MalR招募效率的关系。结果显示，PmalA1的最大输出与IPTG诱导的Pgrac相当，但泄漏表达仅为Pgrac的34.9%，动态范围提升至47.1倍；而间距缩短突变（PmalA2）则启动子活性消失，表明operator-启动子区的精确空间是转录激活的必要条件。甘露糖系统（PmanA/PmanR）：PmanA的天然活性显著高于PmanR，且泄漏更低。对PmanR的cre位点引入与PmalA1相同的双碱基突变（生成PmanR1、PmanR2），分别使其最大输出提升24.7%和5.9%。山梨醇系统（PmtlA）：经评估确认山梨醇的诱导效果显著优于其同分异构体甘露醇。对PmtlA的cre位点进行CG→AT突变获得PmtlA1，最大输出提升57.9%，泄漏降低70.4%，动态范围达49.0倍。阿拉伯糖系统（ParaA/ParaE）：作为受AraR负调控的启动子，ParaA1和ParaE1通过operator优化分别使最大输出提升39.8%和55.5%。在质粒中额外引入araR拷贝（ParaER/ParaER1）可进一步降低背景表达，但伴随诱导输出的下降，符合阻遏蛋白浓度与启动子活性的负相关关系。甘油系统（PglpD）：cre位点突变（PglpD1）使最大输出提升4.7%。通过调节转录激活蛋白GlpP的表达水平，发现PglpD的活性与GlpP浓度呈正相关。木糖系统（PxylA）：宿主G600已基因组整合PxylR-PxylA-comK盒式结构。额外引入xylR拷贝（PxylAR）显著降低了最大输出与泄漏，表明增加阻遏蛋白丰度可有效压缩系统的动态响应区间。综上，启动子工程模块为MICA系统提供了覆盖强、中、弱不同输出梯度的调控元件库。

图2.14种工程化启动子的泄漏与最大输出对比（有无诱导剂）。

T7 RNAP转录放大模块的构建与泄漏控制

为突破天然启动子的表达上限，研究团队在染色体水平构建了T7RNA聚合酶级联表达系统，以优化后的碳源启动子驱动T7RNAP，再由T7启动子驱动目标基因，构建了BST7Mal、BST7Man、BST7Mtl、BST7Ara、BST7Glp、BST7Xyl六株底盘菌。

PT7malA1的最大输出较PmalA1提升94%；PT7araA1提升129.1%；PT7manA提升69.6%。同时，所有系统的诱导灵敏度显著提高，达到饱和诱导所需的诱导剂浓度降低80%–90%。T7级联在麦芽糖、甘露糖和山梨醇系统中导致泄漏显著上升（分别增加4.03倍、21.63倍和15.76倍），动态范围被压缩，相反在阿拉伯糖（PT7araA1）和木糖（PT7xylA）系统因具备充足的内源阻遏蛋白缓冲，成功维持了高动态范围（分别为25.71和36.81），且PT7xylA的泄漏较母系统降低4.1%。为缓解T7系统的泄漏问题，研究团队在PT7下游插入了一个cre操作子位点，形成受CCR二次调控的"闸门"，该策略使PT7malA1cre、PT7manAcre等系统的泄漏分别降低87.7%和29.8%，虽伴随最大输出的相应下降，但显著扩展了系统的动态控制边界，尤其适用于毒性蛋白的生产场景。

图3.PT7malA1、PT7manA、PT7mtlA1等系统的剂量-响应曲线及定量参数。

碳代谢物阻遏介导的自动诱导行为解析

由于MICA系统的自动诱导逻辑建立在枯草芽孢杆菌的碳代谢物阻遏（CCR）机制之上。当葡萄糖与次级碳源（诱导剂）共存时，葡萄糖通过CCR抑制次级碳源的摄取与代谢；随着葡萄糖耗尽，CCR解除，次级碳源被激活利用，同时启动目标基因表达，研究团队系统表征了六种碳源系统在不同初始葡萄糖浓度（0–20g/L）下的时序表达强度。强自动诱导行为，PmalA及PmanR系列表现出严格的CCR依赖性，以PmalA1为例，当初始葡萄糖浓度从0.5g/L递增至5g/L时，诱导窗口系统性地从3–6h延迟至12–18h，荧光强度的激增与葡萄糖耗尽及麦芽糖摄取启动的时间点精确同步。中等自动诱导行为，PmanA在葡萄糖存在下表现出部分早期泄漏，提示其cre位点与CCR机制的耦合不够严格。弱/无自动诱导行为，PmtlA1、Para系列、PglpD及PT7xylA的诱导曲线在不同葡萄糖浓度下高度重叠，表明这些系统对CCR不敏感或已丧失葡萄糖依赖性，这归因于cre位点与核心启动子的空间距离、非PTS转运系统导致的代谢通量不足，以及阻遏蛋白水平的差异。该模块的核心价值在于，无需引入外源感应回路或群体感应系统，仅通过调整培养基中的初始葡萄糖浓度，即可对诱导时机进行程序化控制，实现生长与生产的时序解耦。

图4.PmalA1在不同初始葡萄糖浓度下的荧光-时间曲线。

MICA系统在蛋白分泌与代谢通路调控中的验证

通过重组蛋白分泌表达确认结果，选取碱性蛋白酶（ALP1）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU4A）作为模式蛋白。PmalA1系统在5g/L葡萄糖条件下展现出严格的时序控制，早期（3h）酶活被压制至接近本底，24h葡萄糖耗尽后ALP1活性达437.3U/L，GLU4A达71.2×10³U/L。PmanA系统提供中等强度的时序调控，而PmtlA1系统几乎无自动诱导行为，表现为组成型高表达。

将crtEBI（番茄红素）和crtEBIY（β-胡萝卜素）途径分别置于不同MICA模块控制下。在摇瓶水平，PT7malA1系统产生的番茄红素和β-胡萝卜素分别为82.5mg/L和94.2mg/L，较Pgrac对照分别提升4.5倍和6.3倍。PT7manA系统亦表现出显著优于IPTG的驱动能力。在3L发酵罐补料分批培养中，采用20g/L初始葡萄糖支持细胞高密度生长（OD₆₀₀达142.3），葡萄糖耗尽后通过补加麦芽糖（500g/L储液，维持40–50 g/L）实现自动诱导。β-胡萝卜素在36h达到峰值244.7mg/L，为目前枯草芽孢杆菌中β-胡萝卜素产量的最高报道，验证了MICA系统从摇瓶到反应器的稳健放大能力。

图5.3L反应器中葡萄糖/麦芽糖浓度、生物量（OD₆₀₀）及β-胡萝卜素产量的时程曲线。

结论

本研究构建了MICA系统，一个基于内源碳源响应回路的模块化、可扩展诱导表达平台。通过启动子工程、T7RNAP级联放大及CCR介导的自动诱导三层架构，系统解决了工业发酵中化学诱导剂成本高、毒性大及调控不灵活的瓶颈。六种可代谢诱导剂（麦芽糖、甘露糖、山梨醇、阿拉伯糖、木糖、甘油）成本远低于IPTG，且可作为辅助碳源支持细胞生长，诱导剂用量减少1–2个数量级；通过初始葡萄糖浓度即可编程诱导时机，实现生长与生产的自动解耦；不同碳源系统提供了从严格自动诱导到组成型高表达的多样化选择。优化后的MICA模块最大输出达到或超越Pgrac水平，T7放大后灵敏度显著提升；在蛋白分泌和类胡萝卜素合成中均实现了高效表达，3L发酵罐中β-胡萝卜素产量达244.7mg/L。部分T7耦合系统的泄漏表达仍需进一步收紧，可引入T7溶菌酶或抗T7因子等负调控元件；自动诱导动力学受菌株生理状态与培养基组成影响，可结合数学模型提升预测精度；碳源进入中心代谢可能引发途径间串扰，需通过代谢组学指导进行优化。总体而言，MICA系统为枯草芽孢杆菌的工业级蛋白制造与代谢工程提供了兼具经济性、安全性与可扩展性的通用调控工具箱。