甲基萘醌-4 (MK-4)是一种有价值的维生素K2，具有凝血、预防骨质疏松、减少认知疾病、预防糖尿病、减轻心血管钙化、抑制炎症等重要作用，被广泛用于食品、保健和制药行业的药物治疗和膳食补充剂。MK-4很难化学合成，目前主要通过微生物发酵生产。江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室堵国成研究团队在Enzyme and Microbial Technology上发表题为Combinatorial engineering for improved menaquinone-4 biosynthesis in Bacillus subtilis的文章，通过在枯草芽孢杆菌168中重建MK-4生物合成途径、工程化MEP途径、异质MVA类异戊二烯途径和增强甲基萘醌途径的代谢通量，得到的最佳工程菌株BY23在250mL摇瓶中MK-4产量提高到约120.1mg/L，在3L补料式反应器中发酵后更最高达145mg/L，为工业化发酵生产奠定了基础。

    与MK-4合成相关的代谢网络包括4个模块，即草莽酸合成模块提供芳香头部、甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)模块和甲戊酸依赖(MVA)类异戊二烯模块提供C20类异戊二烯尾部，最后由甲基萘醌模块合成最终产物MK-4。MEP模块中包含8个基因，其中dxs和dxr编码的两种酶一直被认为是限速酶。menA编码的酶催化芳香头部与类异戊二烯尾部结合，也被认为是合成的限速反应。

图1 枯草芽孢杆菌中MK-4生物合成途径

    野生型枯草芽孢杆菌中MK-4的合成途径完整，但没有产生MK-4，可能是关键酶的催化活性较低。将源于集胞藻PCC 6803的menA和menG基因整合到168菌株的染色体上，得到的BY01能产生6.1mg/L的MK-4。然而，这两个基因组合表达会使细胞生长下降。进一步将香叶基二磷酸合成酶基因crtE整合到BY01染色体上，得到BY02产量为8.1mg/L。crtE表达后对细胞生长的影响较小。MK-4在胞内和上清液中含量几乎相同。因此，menA和menG的表达有利于MK-4合成。

图2 集胞藻相关基因表达后促进MK-4合成

    hepT基因编码二磷酸七烯基合成酶，在催化法尼基二磷酸FPP转化为二磷酸七烯基二磷酸HDP中起重要作用，与MK-4合成途径相竞争。敲除hepT得到的菌株BY03，MK-4的滴度达到31.53mg/L，提高了3.8倍，且对细胞生长没有明显影响。因此，过表达合成途径中正作用酶和缺失竞争途径中的酶，可以显著提高MK-4效价。hepT缺失可以减少FPP的消耗，FPP可用于合成MK-4的前体香叶基二磷酸GGPP。进一步设计了MEP通路来改善IPP的供给。

图3 敲除hepT后促进MK-4合成

    MEP途径提供DMAPP及其异构体IPP合成类异戊二烯，包含8个基因，其中dxs、dxr和ispD-ispF基因是增加碳通量的关键。用P43启动子分别过表达这三个基因，得到菌株BY04~06。过表达后对细胞生长的影响较小。发酵后测得，BY04的MK-4产量65mg/L，提高106.3%。BY05的产量达到58.2mg/L，提高了84.7%。BY06产生了55.5mg/L的MK-4，比BY03增加了76.1%。进一步对这三个基因组合过表达，构建菌株BY07~10，测得MK-4的滴度在63~78mg/L。因此，IPP供应不足确实是MK-4合成的限速步骤，MEP通路中限速酶的过表达是提高产量的有效策略。

图4 过表达MEP途径限速酶改善IPP供应

    进一步引入MVA通路，通过表达异质基因增加前体IPP供应。将乳酸菌的mvaS和mvaA整合到BY10染色体上，得到菌株BY12，而后分别将mvaK1、mvaK2、mvaD依次整合，得到菌株BY13~15。与BY10相比，MVA通路中基因表达后对细胞生长影响较小。最终在表达整个MVA途径的BY15中MK-4含量为90.1mg/L，比BY10增加15.5%。表明MVA途径基因表达使更多碳通量流向MK-4。MVA和MEP两种途径的协同作用成功提高了MK-4滴度，这种策略可用于提高微生物中多种萜类化合物的产量。

图5 MVA途径促进MK-4生物合成

   在枯草芽孢杆菌中，甲基萘醌包括上游和下游途径。将下游途径中基因ispA、crtE、menA和menG分别整合到BY15染色体上，得到菌株BY16~19。这些基因过表达后不影响细胞生长。BY16中MK-4产量有所下降，BY17中为113mg/L，提高25.4%，BY18为100mg/L，提高了10.9%，BY19为94.1mg/L。说明crtE和menA对MK-4的合成有帮助，而menG影响不大。进一步将crtE、menA和menG的不同组合整合到BY15中，得到BY20~23。其中三个基因联合过表达的BY23中，MK-4产量最高，达到120.1mg/L，比BY15增加33.3%。表明强化MEP和构建MVA途径改善IPP供应是实现MK-4高效合成的关键。

图6 MK-4合成甲基萘醌途径的增强

    最后在3L反应器中对BY23进行补料分批培养。在发酵第一天就检测到MK-4，并且上清中产量高于胞内。培养时葡萄糖浓度控制在3~10g/L，在第二天和第四天时，分别添加1%甘油和2%大豆蛋白胨。细胞密度在72h时达到最大OD值35，随后逐渐降低。在无pH控制培养下，MK-4产量在第6天达到145mg/L。表明葡萄糖浓度控制的补料分批培养有利于BY23生产MK-4，为规模化奠定了基础，同时GRAS安全的枯草芽孢杆菌适合于工业生产。本策略也适于其他高价值戊烯基化学品。

图7 菌株BY23在3L罐中发酵生产MK-4

    本研究证实枯草芽孢杆菌中Dxs、Dxr和IspD-IspF，集胞藻中CrtE和MenA是MK-4合成中MEP途径和甲基萘醌途径的限速酶，敲除hepT也能显著增产。最终工程菌株BY23在烧瓶中MK-4的产量为120.1mg/L，是初始菌株的19.6倍。在3L反应器中发酵后产量达到145mg/L。表明通过外源蛋白表达和合成途径组合工程，提高枯草芽孢杆菌中MK-4产量是可行的。该策略也可用于其他戊酰化产物的合成，具有重要理论和工业应用意义。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2020.109652