近期，江南大学生物工程学院、糖化学与生物技术教育部重点实验室尹健教授团队在致病菌糖链抗原的全合成及抗原性研究方面取得新进展，研究成果“Chemical Synthesis and Antigenicity Evaluation of an Aminoglycoside Trisaccharide Repeating Unit of Pseudomonas aeruginosa Serotype O5 O-Antigen Containing a Rare Dimeric-ManpN3NA”在线发表于化学领域著名期刊Journal of the American Chemical Society。

     糖疫苗工程是生物医药化工的重要分支，旨在通过发展糖链的化学工业合成技术和生物合成技术，融合糖芯片等医药化工前沿技术，推动糖链抗原的免疫表位解析、优选和改造、规模化制备，糖与载体蛋白的精准、可控结合，新型糖疫苗的创制，多联多价糖疫苗的开发，糖疫苗全链条、全维度精准质控等。尹健教授团队一直致力于糖疫苗工程的研究，聚焦已有糖疫苗的迭代升级和新型糖疫苗的创制。

绿脓杆菌是引起医院感染的主要病原体之一，导致的死亡率约为5.3％。随着绿脓杆菌抗生素耐药性的不断提高，开发安全、高效的绿脓杆菌疫苗已成为国家保障人民生命健康的重要需求。研究表明，人体免疫系统可对绿脓杆菌脂多糖O-抗原产生保护性免疫，因此O-抗原作为免疫靶点已广泛用于绿脓杆菌疫苗的开发。绿脓杆菌O5血清型O-抗原由三糖重复单元[→4)-β-D-ManpNAc3NAmA-(1→4)-β-D-ManpNAc3NAcA-(1→3)-α-D-FucpNAc-(1→]组成（图1），其中非还原端2,3-氨基-D-甘露糖醛酸C3位修饰有碱性乙脒基。该三糖全部由稀有单糖组成，其中两种连续的β-D-ManpN3NA二糖自然界中罕见，所有糖苷键连接均为1,2-顺式-糖苷键，包括两个β-D-甘露糖苷键和一个α-D-岩藻糖苷键，另外三糖上糖环的高度功能化修饰，进一步增加了其化学合成的挑战性。发展绿脓杆菌O5血清型O-抗原寡糖的化学合成方法，并将合成寡糖应用于生物医药研究，将为明确这一结构特异性糖链的免疫活性构效关系提供基础。

▲ 图1. 绿脓杆菌O5血清型O-抗原三糖重复单元

     尹健教授团队利用酰基远程参与（O4-Bz）和试剂调控（TMSI-Ph3PO）的协同作用，实现α-D-岩藻糖胺糖苷键的高效构建。利用1,2-反式-β-糖基化和C2位构型翻转策略，实现两种2,3-二氨基-β-D-甘露糖醛酸糖苷键的专一性构建。三糖组装过程中，发现还原端单糖供体和二糖受体的反应活性均受糖环取代基的影响，尤其是糖基供体和受体的C6位氧化状态对糖基化反应起到关键性作用。发现当二糖受体C6位为羧酸苄酯的情况下，通过采用叠氮基而非乙酰氨基作为糖环取代基，可有效提高二糖受体C4位羟基的亲核性，并能够实现与大多数糖基供体的糖基化反应。然而，当供体C6位为羧酸苄酯的情况下，反应效率普遍较低。因此，为了提高糖基供体的反应活性，决定在三糖阶段开展C6位羟基的氧化，以避免其反应活性较低对三糖合成整体效率造成的不利影响。通过改变糖基供体的氧化转态，显著提高了目标三糖的糖基反应效率。在三糖阶段利用策略性正交修饰，完成氨基上一个稀有乙脒基（Am）和四个乙酰基（Ac）的组装，实现糖环上不同氨基的功能化正交修饰。另外，当C3位组装乙脒基后，由于乙脒基的碱性作用会导致三糖在甲醇溶解中发生酯交换，由羧酸苄酯转化为羧酸甲酯，需进一步碱性脱除。最后，经全脱保护完成了目标三糖的首次全合成。

     在糖基受体中增加供电子性保护基和减少吸电子性保护基可以提高糖基受体反应活性已被熟知，但是其理论机制并未充分阐明。尹健教授团队基于具有不同反应活性的2种二糖受体8和27，利用量子化学计算探究了糖基受体活性调控的理论机制（图2）。首先，计算得到了糖基受体的优势构象，发现不同活性的糖基受体优势构象无显著差异。鉴于糖基受体的羟基需亲核进攻糖基供体，通过轨道权重福井函数和双描述符对不同糖基受体羟基的亲核性进行定量分析，可直观的呈现出高活性糖基受体是亲核性占主导，而低活性受体则有较高比例的亲电性。为了进一步定量比较不同分子羟基的亲核性，引入软度参数与福井函数（fw-）结合，从而更准确地定量分析不同分子间亲核性的差异。

▲ 图2. 糖基受体的轨道权重福井函数和双描述符分析

     此外，为了评价O5血清型O-抗原寡糖片段的抗原性，进一步制备了无乙脒基三糖、还原端二糖和D-岩藻糖胺等寡糖片段（图3）。通过糖芯片技术，利用16名绿脓杆菌感染患者和16名健康供体的血清样品（阴性对照）对合成寡糖的抗原性进行筛选。糖芯片分析结果显示，尽管绿脓杆菌血清型分布有所不同，目标三糖1和2可以被大多数患者的血清样本中IgG抗体识别（14/16）。值得注意的是，三糖2（无乙脒基）与IgG抗体结合亲和力比三糖1的更强，该结果表明，稀有乙脒基并不是O5血清型O-抗原抗原性的关键决定因素。与三糖2相比，仅含有一个β-D-ManpNAc3NAcA基序的二糖52，同样能被大多数患者血清样本中IgG抗体识别，但其结合亲和力较弱，表明关键β-D-ManpNAc3NAcA基序对其抗原性具有重要作用。通过健康供体血清的筛选结果显示，大多数血清样本无法识别O5血清型O-抗原的合成寡糖，表明绿脓杆菌感染患者血清中的IgG抗体可以特异性靶向三糖1和2。上述结果表明，两种三糖均为绿脓杆菌O5血清型O-抗原的有效抗原表位，且乙脒基并非构成O-抗原抗原性的关键结构因子，稀有糖β-D-ManpNAc3NacA是O-抗原抗原性的关键组成片段。本研究结果为绿脓杆菌O5血清型O-抗原疫苗的研发提供了理论基础。

▲ 图3. 绿脓杆菌O5血清型O-抗原寡糖的抗原性分析

      尹健教授为该论文的通讯作者，我校青年教师田光宗为论文第一作者，胡静研究员和秦春君副研究员为论文的共同第一作者。上述研究得到了国家自然科学基金（22325803, 22077052, 22277042, 22107037, 22177041, 22207042），国家重点研发计划（2023YFC2308000）的资助。研究团队特别感谢江南大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室顾小红老师、江南大学生物工程学院刘海丽老师对本研究的支持。