大肠杆菌合成烟酰胺单核苷酸途径构建及发酵工艺研究

作者：

程琳1,2,3，龚劲松2，Michael Hall4，苏畅2，徐国强3，许正宏1,3，史劲松1,2*

单位：

1．江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室

2．江南大学 生命科学与健康工程学院

3．江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心

4．Seragon Biosciences, Inc., CA, Irvine

基金项目：

国家自然基金面上项目（21978116）；江苏省自然基金（BK20221082）；中央高校基本科研业务费专项资金（JUSRP22047）

摘要&关键词

摘要：β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide，NMN）作为人体内重要辅酶NAD⁺的直接前体受到了广泛关注，目前工业上主要采用化学法或化学-酶催化法进行合成，发酵法仍未取得突破。为获得一株高产NMN的工程菌株，对大肠杆菌进行了代谢途径改造。首先在大肠杆菌中异源表达了来自松噬几丁质菌（Chitinophaga pinensis）的烟酰胺磷酸核糖转移酶，构建了NMN的补救合成途径；为增强前体5-磷酸核糖-1-焦磷酸（5-phosphoribose 1-pyrophosphate，PRPP）的供应，过表达了从葡萄糖出发的多个途径酶，促进了葡萄糖向磷酸戊糖途径的流动；同时，为有利于NMN积累，通过敲除NMN下游代谢分解途径基因pncC、ushA以及调控NAD⁺衍生物基因nadR，所获得的重组菌产量摇瓶水平达到60 mg/L，是初始产量的4.95倍；进一步在5 L罐上进行发酵试验，产量最高达到390.1 mg/L。该菌株用于NMN的发酵生产具有良好的潜力，后续通过优化放大有望进一步提升产量。

关键词：代谢网络；基因调控；烟酰胺单核苷酸；5-磷酸核糖1-焦磷酸；发酵工艺

主要结论

为获得一株高产NMN的工程菌株，本研究以大肠杆菌BL21（DE3）作为表达宿主，通过引入外源松噬几丁质菌的Nampt基因，在大肠杆菌中成功实现了NMN的生物合成。通过强化表达大肠杆菌自身的zwf、pgl、gnd、ripA、ripB、prs基因，增强了PRPP途径的合成能力，有效促进了目标产物NMN的积累。为了使大肠杆菌有效积累产物NMN，敲除了NMN的代谢基因pncC、ushA以及衍生物调控因子nadR，有效弱化NMN的降解。在此基础上通过重组菌株的发酵工艺的初步研究，使菌株的摇瓶最高产量为60 mg/L，5 L发酵罐产量达到390.1 mg/L。

图1 大肠杆菌利用葡萄糖和烟酰胺合成NMN的代谢途径

Fig. 1 Synthesis of NMN by E. coli using glucose and niacinamide

注：红色箭头表示利用质粒进行过表达，pncC、ushA、nadR为本研究敲除基因。

a-流加葡萄糖、烟酰胺的发酵过程参数；b-补料培养基、葡萄糖、烟酰胺的发酵过程参数

图2 重组菌在5 L发酵罐中发酵生产NMN的过程曲线

Fig. 2 Process curve of NMN production by the recombinant strain in 5 L fermenter

本工作通过多种代谢策略提高NMN的发酵产量，最终获得一株产NMN性能提升的工程菌株，并通过5L小罐的不同发酵方式探究NMN发酵关键参数，为有效合成NMN以及工业化生产提供借鉴，后续通过优化放大有望进一步提升产量。