近期，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室刘延峰研究员课题组在基于CRISPR的毕赤酵母基因组编辑效率方面取得重要进展，研究成果“Heterologous Single-Strand DNA-Annealing and Binding Protein Enhance CRISPR-Based Genome Editing Efficiency in Komagataella phaffii”发表于ACS Synthetic Biology (2023, 12(11):3443-3453)。作为一个稳定且成熟的蛋白质生产平台，毕赤酵母已广泛应用于工业酶和生物制药行业。高效的基因组编辑工具对于实现目的蛋白的高产至关重要，因为高效的蛋白质生产包含多个环节，涉及多种基因，包括提高转录效率的转录因子、促进蛋白质折叠的伴侣、参与靶蛋白降解的蛋白酶以及与糖基化相关的基因。在一些微生物中已经鉴定出一类实现有效重组的单链 DNA 退火蛋白 （SSAP）。从进化上讲，SSAP 是一个独特的重组蛋白家族，独立于细菌 RecA 或真核生物 RAD51。SSAP可以与ssDNA或dsDNA底物结合，并通过刺激互补单链区域的退火来促进同源DNA序列之间的链交换。并且，这些蛋白质特异性识别宿主单链 DNA 结合蛋白（SSB）的C末端尾部，如果保持与该宿主结构域的相容性，则可以在物种之间转移。配对SSAP和SSB的可移植性为真核生物的基因编辑提供了可能性。为了在毕赤酵母中实现更高效的基因组编辑效率，陈坚院士团队刘延峰研究员课题组首先评估了各种微生物SSAPs对毕赤酵母基因组整合效率和菌落形成单位数的影响，包括LBet（来自噬菌体λ）、gp2.5（来自噬菌体T7）、PapRecT（来自铜绿假单胞菌噬菌体）和CspRecT（来自Collinsella stercoris噬菌体），结果表明带有PapRecT的菌株形成的转化子数量明显高于其他菌株，但是基因组整合SSAP的毕赤酵母菌株生长速率明显下降。因此，进一步的设计和构建了包含PapRecT及其对应的SSB（PaSSB）的非宿主依赖的CRISPR质粒，同时优化了CRISPR质粒的复制子、sgRNA的启动子。在菌株X33进行单基因整合和删除测试，实现了具有50 bp短同源臂的异源基因的100%效率整合和具有1000 bp同源臂的100%效率的单基因删除。为了验证在不同菌株和不同位点的整合效率，进一步的在X33和GS115的三个不同整合位点进行了具有 50 bp同源臂的sfGFP表达框的插入。X33和GS115所有三个位点都实现了效率高于85%的整合。为了应用于毕赤酵母α-乳白蛋白的生产，利用该工具通过加强磷脂生物合成来修饰内质网膜系统，并通过过表达转录因子Gal4-like和翻译起始因子Pab1来增强重组蛋白转录和翻译，以提高人源α-乳白蛋白的产量。在3 L发酵罐中进行高细胞密度发酵，α-乳白蛋白的产量最终提高到113.4 mg/L。刘延峰研究员为论文的通讯作者，2020级博士生邓梦婷为第一作者，陈坚院士、堵国成教授、刘龙教授、李江华教授、吕雪芹副研究员是论文共同作者。上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2020YFA0908300）、国家自然科学基金优秀青年基金（32222069）、江苏省优秀青年基金（BK20200085）项目的资助。

图1 异源单链DNA退火和结合蛋白提升毕赤酵母基因编辑效率及乳蛋白合成