近日，ACS Synthetic Biology在线发表了江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授课题组的研究成果“Efficient protein expression and biosynthetic gene cluster regulation in Bacillus subtilis driven by a T7-BOOST system”（Wu et al., ACS Synth. Biol., 2023, 12: 3328-3339）。博士后武耀康为论文第一作者，吕雪芹副研究员为通讯作者。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是革兰氏阳性模式微生物，具有遗传背景清晰、无明显密码子偏好性等优势，在工业生产中具有广泛应用。由于具有高特异性和超强的表达强度，基于T7 RNA聚合酶（T7RNAP）和T7启动子（P_T7）的表达系统被广泛用于大肠杆菌中重组蛋白的生产，尽管目前已有研究尝试将T7表达系统适配于B. subtilis，但它们都具有一定的局限性，如使用特定的底盘菌株和过时的基因组编辑方法。为解决上述问题，该研究基于CRISPR/Cpf1与T7表达元件设计创制了一个“即插即用”的双模块T7-BOOST（T7-Based Optimized Output Strategy for Transcription）系统，该系统具有低泄露表达和高动态范围等优点。在T7RNAP驱动模块中，使用IPTG诱导启动子P_hy-spank或木糖诱导启动子P_xylA调控T7RNAP的表达，并通过CRISPR/Cpf1以“即插即用”的方式整合到所需B. subtilis菌株的基因组中；在表达控制模块中，通过将相应的操纵子序列lacO或xylO与P_T7进行杂交，获得了用于目的基因表达的嵌合启动子P_T7lac或P_T7xyl。随后，使用绿色荧光蛋白作为报告基因，在三个不同拷贝数的质粒中对T7-BOOST系统的性能进行了系统表征，与两种诱导型启动子P_hy-spank和P_xylA相比，T7-BOOST系统表现出更小的泄漏表达和更宽的动态范围，这归因于两个模块的双重抑制和T7RNAP的强转录活性。最后，以胞外蛋白酶缺失和可形成超级感受态的B. subtilis菌株G600为底盘，验证了T7-BOOST系统在蛋白表达以及生物合成基因簇调控中的应用。总之，上述T7-BOOST系统能够实现基因的严格、可调和灵活表达调控，可被应用于B. subtilis的合成生物学和代谢工程研究中。T7-BOOST系统相关质粒已存储于MolecularCloud质粒共享平台，可通过编号MC_0068418、MC_0101256、MC_0101409、MC_0101411~ MC_0101414获取。上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2020YFA090830、 2018YFA0900300）、国家自然科学基金（32021005、32070085、31930085、32300064）、博士后创新人才支持计划（BX2021113）、江苏省自然科学基金（BK20221083）、中国博士后科学基金（2021M701458）等项目的资助。

图1  B. subtilis中“即插即用”T7-BOOST系统的设计创制

图2 IPTG与木糖诱导型T7-BOOST系统的表征

图3 IPTG与木糖诱导型T7-BOOST系统的剂量依赖曲线

图4 T7-BOOST系统的在全细胞催化与蛋白表达中的应用

图5 T7-BOOST系统在基因簇表达调控中的应用