2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)是母乳中含量最丰富的人乳低聚糖，在婴儿免疫系统发育、肠道菌群调节、病原感染抑制等方面起着至关重要的作用，已被批准作为婴儿配方奶粉的添加剂。然而，从头合成2'-FL的的低效率限制了大规模生物生产。近日，江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授团队在Microbial Cell Factories发表题为Engineered Bacillus subtilis for the de novo production of 2'-fucosyllactose的文章，在枯草芽孢杆菌中引入一条全新的生物合成途径，通过减少竞争性消耗，增加和前体供应，启动子工程等方法实现了2'-FL的从头合成，在3L反应器中产量达到88.3g/L，产率为0.61g/g乳糖。

     从头合成2'-FL从甘露糖-6-磷酸(M6P)开始，由四种酶催化生成GDP-L-岩藻糖，再通过α-1,2-岩藻糖转移酶(futC)生成终产物。该途径利用蔗糖、乳糖等低成本碳源，更为经济。枯草芽孢杆菌作为GRAS安全的宿主，适用于工业生产2'-FL等功能性营养物质。

图1 以蔗糖和乳糖为碳源从头合成2'-FL

   首先，测试枯草芽孢杆菌对2'-FL的耐受性。在10、20、30g/L浓度2'-FL的LB培养基中，枯草芽孢杆菌的最大OD值分别下降9.62%、10.40%、11.17%，略低于对照组，但随着浓度的增加，OD值无明显下降，且不能利用2'-FL为碳源进行生长。说明枯草芽孢杆菌可以作为2'-FL生产的宿主。

图2 枯草芽孢杆菌对2'-FL的耐受性

     GDP-L-岩藻糖是合成的关键前体。将大肠杆菌中合成GDP-L-岩藻糖的manB、manC、gmd和wcaG以及幽门螺杆菌的futC的启动子替换为P43，并导入枯草芽孢杆菌168基因组中，构建从头合成途径，获得菌株BS0。经检测未生成GDP-L-岩藻糖。用质粒pP43NMK分别表达manB、manC、gmd和wcaG，验证时发现manC未表达。用诱导型启动子PxylA替换P43，构建菌株BS2，其在摇瓶中积累了1.12g/L的2'-FL。LC/MS鉴定也表明manC被成功转录和翻译，2'-FL最终在枯草芽孢杆菌中合成。

图3 菌株BS2成功合成2'-FL

     乳糖是从头合成的重要前体。在乳糖浓度递增的培养基中，枯草芽孢杆菌消耗了70-90%，并且OD值递增，表明过量乳糖可以被分解促进细胞生长。单独或联合敲除编码β-半乳糖苷酶的yesZ和ganA后，2'-FL滴度分别提高至1.22、1.22和1.31g/L。合成GDP-L-岩藻糖需要GTP和NADPH作为供体和能量来源。在各类启动子中过表达ndk，该基因将GMP转化为GTP。结果表明，菌株BS7(PxylA-ndk)和BS8(Phbs-ndk)的2'-FL滴度分别上升至1.41和1.43g/L，其余菌株滴度下降。M6P是GDP-L-岩藻糖的前体，由manA和yvyI编码的异构酶催化合成。在BS8中引入了包含原始启动子和强启动子的manA和yvyI表达盒，构建4株整合菌株，所有基因插入均对积累有正向影响，其中Pnative-manA表达盒的BS12提高最显著，达1.84g/L。

图4 增加乳糖、M6P和GTP的供给

     这些菌株需要木糖作为诱导剂。进一步进行碳源补充发酵，单独添加木糖使滴度提高78.59%(2.00g/L)，单独添加乳糖或蔗糖分别提高27.91%和20.77%。表明增加诱导剂对提高滴度最有效。三种糖同时加入，2'-FL的滴度提高129.72%，摇瓶中产量达2.57g/L。考虑到木糖成本高昂不适于工业化生产。使用7个表达水平逐渐增加的启动子P1-P7替代PxylA。携带P1-P6的菌株滴度都有下降。而P7的菌株BS20滴度最高，达2.88g/L。再通过优化碳源比例，在发酵开始时加入80g/L蔗糖和20g/L乳糖，72h后的滴度达到14.06g/L。

图5 发酵过程及manC基因表达优化

     进一步在3L反应器中验证BS20的生产能力。在发酵12h时2'-FL滴度停止上升，而OD值继续上升，最终获得了36.09g/L的滴度。从头合成途径中的外源基因均以组成型启动子表达，不受转录抑制。而内源性manA受上游转录激活因子manR的抑制。这可能是12小时后合成停止的原因。根据上述分析，将BS20中manA的启动子替换为组成型启动子P7，得到菌株BS21。通过qRT-PCR分析相对转录水平。BS20在24h的manA表达量下降至12h的66.4%，而BS21在24h的表达量是12h的2.297倍。菌株BS21的2'-FL滴度为18.27g/L，是BS20的1.28倍。表明manA的转录调控确实阻碍了发酵后期的连续合成，而采用组成型启动子可以解决这一问题。

图6 改造manA转录调控系统，促进2'-FL持续合成

     最终构建的工程菌株BS21在3L反应器发酵，pH保持在6.0-6.5，蔗糖和乳糖浓度分别维持在10-30g/L和10-20g/L。最终2'-FL产量为88.3g/L，产率为0.61g/g乳糖，是目前报道的最高水平。

图7 BS21菌株在3L反应器中2'-FL产量水平

     本研究在枯草芽孢杆菌中构建了2'-FL的从头合成途径，并通过增加M6P、乳糖和辅因子GTP的供给，用P7启动子表达manA等方法，使最终工程菌株BS21在3L反应器中生产2'-FL的滴度达到88.3g/L，为日后大规模生物生产奠定了基础。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1186/s12934-022-01838-w