枯草芽孢杆菌是一种广泛用于工业生产重组蛋白的革兰阳性土壤细菌。因具有无毒性、高分泌能力、易于遗传操作和高细胞密度等优点，被广泛用作标准宿主菌株。但在外源蛋白产物分泌效率上，尤其是对宿主细胞有害的蛋白，仍有很多问题尚未解决。来自江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室的刘龙团队在Bioresource Technology上发表题为A genetic toolkit for efficient production of secretory protein in Bacillus subtilis的文章，开发了一个提高枯草芽孢杆菌外源蛋白分泌效率的遗传工具箱。最终使用重构的Bs168菌株和优化的启动子、信号肽表达了粘质沙雷氏菌非特异性内切酶(SMNE)，摇瓶酶活达7.5×106U/L，是对照组的7.5倍。

    枯草芽孢杆菌中，有8种非必需的胞外蛋白酶(AprE、NprE、Epr、Mpr、Bpr、NprB、Vpr和WprA)，可强烈降解外源分泌蛋白，导致目标产物大量丢失。首先重建BS168菌株，过表达comK使产生超级感受态（同时使epr失活），反向突变trpC2和gudB，获得不依赖色氨酸并能利用谷氨酸家族的菌株BSZRG。敲除5个蛋白酶基因构建G601菌株，引入无义突变灭活5种和7种蛋白酶，分别获得G600和G800。对三个菌株胞外蛋白酶活性进行表征，发现其胞外蛋白含量、总蛋白含量、生长速度和转化效率都优于两个对照。综合考虑胞外蛋白产量和蛋白酶活性，选择菌株G600进一步研究。

图1 枯草芽孢杆菌的重构与表征

    在枯草芽孢杆菌中，共有17种σ因子负责识别启动子，指导RNA聚合酶转录。大多数高表达的基因的启动子都依赖σA，在整个生长过程中持续表达，受环境的影响最小。而其他σ因子依赖性启动子只在特定环境中表达，不适合表达目标蛋白。利用包含σA依赖启动子的保守序列构建启动子文库。用流式细胞术对大肠杆菌中低表达的启动子进行首次筛选，对枯草杆菌中高表达的启动子进行二次筛选。选出21个启动子进行表征，所有启动子在大肠杆菌中均强表达，在枯草杆菌中表达强度差异大。因此未能获得用于枯草芽孢杆菌分泌蛋白表达的启动子。

图2 合成启动子的筛选与表征

    从DBTBS数据库的114个组成型启动子中选择10个最强的启动子，表征在大肠杆菌和枯草杆菌中的强度。发现在大肠杆菌中，Phag和PspovG中的保守序列不能被σ因子识别，因此不表达。而在枯草芽孢杆菌中，PspovG表达强度最高，是P43的1.48倍，并能持续表达。研究PspovG表达复杂代谢合成途径，发现对基因簇的表达能力更强，是一个强大的多功能启动子。

图3 内源启动子的筛选与表征

    以穿梭质粒pSTOP1622为载体，选择组成型启动子Phag和PspovG，以及诱导型启动子PxylA和Pgrac100，结合SPnprB构建SMNE表达盒，转化G600菌株。得到4株产SMNE菌株。在发酵液上清中检测SMNE酶活性，启动子PspovG的酶活最高，达1×106U/L。为了快速筛选目的蛋白最佳SP，本研究设计了核糖体结合位点-信号肽(RBS-SP)组合优化方法(SCORES)。首先，构建由16个RBS突变体和173个sec型的SP组合的2768个RBS-SP文库。将文库组装成pHT-P21-spovG-RS-SMNE-sfGFP质粒，依次转化大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，再将平板上的转化子加入96孔板，培养后检测荧光强度。最终筛选出高荧光强度的转化子。去除sfGFP基因，获得pHT-P21-spovG-RS(x)-SMNE。用这些质粒转化G600菌株，并进行酶活性测定。

图4 采用SCORES方法进行系统组合优化

    培养板上获得超过3000个克隆，其中576个克隆重新接种到96孔黑板中孵育，90%以上的克隆呈低荧光强度，只有少数克隆(图5A红虚线框)的分泌能力有所提高。提取质粒，测序确定最佳RBS-SP。用质粒pHT-P21-spovG-RS(0-9)-SMNE培养10株菌株，检测其酶活性。菌株RS5和RS8在摇瓶中的酶活达到7.5×106U/L，是对照RS0的7.5倍。SCORES法的2768个组合库涵盖了枯草杆菌所有sec型信号肽，避免了常用方法库容低的弊端，确保了库完整性并显著节省构建时间。

图5 通过SCORES筛选SMNE的RBS-SP组合

   采用G600-SP21-RS8菌株在3L发酵罐中进行补料分批发酵。SMNE的分泌水平在48 h达到最高，此时酶活性为2.12×107U/L。本研究构建了3个蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌底盘，筛选出2个适合外源蛋白表达的启动子。利用SCORES方法优化表达了毒性蛋白SMNE，并且活性达到7.5×106U/L。表明了枯草芽孢杆菌底盘配合基因表达工具箱，高效生产异源蛋白的潜力。

相关论文资料

https://doi.org/10.1016/j.biortech.2022.127885