近日，ACS Synthetic Biology在线发表了江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授课题组的研究成果“Combining CRISPR-Cpf1 and Recombineering Facilitates Fast and Efficient Genome Editing in Escherichia coli”(Zhu et al., ACS Synthetic Biology. 2022. 11: 1897-1907)。江南大学2019级硕士生朱学文为论文第一作者，李江华教授和刘龙教授为论文通讯作者。

在模式工业微生物大肠杆菌（Escherichia coli）中构建便捷、高效的基因编辑工具对构建细胞工厂十分重要。Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins（CRISPR-Cas）系统作为一种细菌抵御外来DNA入侵的主要方式，会识别噬菌体上的特定序列并对其进行切割从而造成DSBs。其中，第2类的CRISPR系统（CRISPR-Cas9，CRISPR-Cpf1）由于其结构及原理比较简单（效应蛋白只包含一种单亚基蛋白的Cas蛋白），在基因编辑中被应用广泛。然而，目前大肠杆菌中的基因编辑工具在单碱基突变以及大片段整合方面的编辑效率仍有待提高，且完成编辑过程需要提前构建所需的同源模板，限制了基因编辑的速度。

针对上述问题，本研究基于CRISPR-Cpf1系统在大肠杆菌中开发了两种高效的基因编辑工具（pEcCpf1/pcrEG和pEcCpf1H/pcrEG）。其中，pEcCpf1/pcrEG系统可以在大肠杆菌中整合9000 bp长度的DNA片段；pEcCpf1H/pcrEG系统可以直接以90-nt的单链引物作为同源修复模板，在大肠杆菌中实现单点突变、终止子插入、短序列插入以及完整的基因敲除，该系统还可以在大肠杆菌中同时敲除或同时修饰两个基因。最后，该研究以L-组氨酸的合成为例，成功验证了上述系统在代谢工程改造大肠杆菌构建高效微生物细胞工厂中的应用。

上述研究得到了国家自然科学基金(31870069，32021005)、中国博士后创新人才计划(BX2021113)、国家重点研发计划(2020YFA0908300和2018YFA0900300)、中央高校基本科研专项资金(JUSRP52019A、JUSRP121010、JUSRP221013)和中国博士后科学基金(2021M701458)等项目的资助。

图1 pEcCpf1/pcrEG介导的基因编辑

图2 pEcCpf1H/pcrEG介导的基因编辑

图3 E. coli BL21 (DE3)中不同位点的基因编辑效率

（A）pEcCpf1/pcrEG介导的基因编辑效率，（B）pEcCpf1H/pcrEG介导的基因编辑效率

图4 其他大肠杆菌中的基因编辑效率

（A）pEcCpf1/pcrEG介导的基因编辑效率，（B）pEcCpf1H/pcrEG介导的基因编辑效率

图5 pEcCpf1/pcrEG和pEcCpf1H/pcrEG在大肠杆菌代谢工程改造中的应用