近日，Bioresource Technology在线发表了糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授课题组的研究成果“High level production of diacetylchitobiose deacetylase by refactoring genetic elements and cellular metabolism” (Mao et al., 2021, Bioresour. Technol., 334: 125836)。江南大学2019级硕士生毛馨竹为论文第一作者，刘龙教授为通讯作者。

氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)在维持骨关节健康以及骨关节疾病治疗等方面具有重要作用。目前生产GlcN方法主要为甲壳素水解法，主要以虾蟹壳或真菌细胞壁为原料，利用强酸进行酸水解反应获取GlcN。该法需使用大量强酸，易造成环境污染，且反应需高温条件下进行，反应条件苛刻，生产过程中步骤复杂，生产效率低。为了尽量避免上述问题，研究者通过微生物发酵法先获取GlcN的前体N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)，之后再采用酸水解法将GlcNAc酸解成GlcN。虽然这在一定程度上减少了酸的使用，但仍难以避免严重环境污染问题，且GlcN产率低，因此难以应用于生产实践和工业化大规模生产。与酸水解法相比，酶法生产GlcN不仅生产工艺简单，而且可以很好地避免酸水解给环境带来的压力和危害。

几丁二糖脱乙酰酶(diacetylchitobiose deacetylase, Dac)来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii，它对GlcNAc单体和二聚体具有很高的催化活性。课题组前期通过定点饱和突变和高通量筛选等策略构建了一株可高效分泌表达Dac的重组枯草芽孢杆菌，但其分泌和表达水平距离大规模工业化仍有很长一段距离，且在后续的研究工作中发现，重组菌株中使用的高拷贝质粒存在不稳定性。

为了解决上述问题，在课题组已有的研究基础上，本研究首先通过信号肽工程筛选并优化信号肽的功能区，最大限度的增强Dac的分泌水平，胞外Dac活性达3682.2 U/mL；随后，通过RBS Calculator (https://salislab.net/software/) 预测和计算初始mRNA翻译率，筛选出胞外Dac活性为4807.6U/mL的WB-NMK-D65-R1；同时，为了克服质粒依赖表达系统存在的不稳定性缺陷，研究人员尝试将Dac合成模块集成到B. subtilis WB600的基因组中，但是B.subtilis WB600的低转化率给基因编辑带来了困难，因此，研究人员参考B. subtilis WB600的构建，在B.subtilis 168的epr位点上整合了comK基因，并使其受到木糖诱导启动子PxylA的控制，进一步沉默bpr、nprB、aprE、mpr和nprE，从而构建新的底盘细胞B. subtilis C6；最后，使用CRISPER/Cpf1系统对B.subtilis C6进行编辑，实现了Dac的整合表达。摇瓶发酵结果显示Dac的胞外酶活性显著提高，达到6357.38 U/mL，是出发菌株的3.11倍，也是目前报道的最高水平。

上述研究工作得到了国家自然科学基金(31930085, 32021005, 31870069)、国家重点研发项目(2018YFA0900300)、中央高校基本科研专项资金(JUSRP221013, JUSRP121010, JUSRP52019A)和山东省重点研发计划(重大科技创新项目) (2019JZZY011002)等项目的资助。

图1 不同信号肽和RBS序列重组菌株的构建

图2 信号肽工程对Dac分泌的影响

图3 RBS序列设计对Dac表达的影响

图4 基于CRISPR/Cpf1系统重构的枯草芽孢杆菌底盘细胞对Dac胞外活性的影响

图5 敲除负调控因子及拷贝数对Dac分泌的影响

图6 重组菌株生理生化特性比较