近日，Green Chemistry以封面文章形式，发表了糖化学与生物技术教育部重点实验室康振教授课题组的研究论文“Biosynthesis of non-animal chondroitin sulfate from methanol using genetically engineered Pichia pastoris”。江南大学2017级博士生金学荣和2018级博士生张维娇为论文共同第一作者，康振教授和李江华教授为论文通讯作者。

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate, CS)是一种广泛分布在软骨组织中的线性糖胺聚糖，由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β(1→3)和β(1→4)糖苷键交替连接并经过一定磺酸化修饰而成。CS广泛应用于临床、医疗和营养保健等领域。然而，当前所有商业化的CS都是来自动物组织提取，这种生产模式存在许多问题，例如动物饲养周长、抗生素的使用、动物排泄物的污染、使用高温及酸碱提取以及产品存在潜在的致病因子等。

为了有效解决上述问题，我们开发了一条有前景的绿色路线，通过工程化的毕赤酵母，利用廉价的甲醇从头合成CS。首先，将来自大肠杆菌K4的kfoC和kfoA，及来自枯草芽孢杆菌的tuaD三个外源基因引入毕赤酵母，构建软骨素合成途径，得到5.5 mg/L的软骨素合成菌株。进一步通过密码子及基因组合优化，软骨素的产量提高了约35倍，达到189.8 mg/L。对6种Kozak序列和10种不同的内源启动子进行比较和分析，实现了软骨素-4-O-磺基转移酶的活性表达（41.3 U/L）。整合软骨素合成模块和磺酸化模块后，工程菌株Pp006成功合成了182.0 mg/L CS [GlcA-GalNAc (4S)]，磺酸化度为1.1%。通过过表达腺苷5'-三磷酸硫酸化酶和腺苷5'-磷酸硫酸激酶，强化了3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)的供给，进一步将硫酸化度提高到2.8%。在3-L发酵罐分批补料培养中，CS最高产量达到2.1 g/L，硫酸化度提高到4.0%。本研究为毕赤酵母细胞工厂代谢合成其他磺酸化糖胺聚糖奠定了基础。

上述研究得到了江苏省杰出青年科学基金(BK20200025)、国家自然科学基金(32000058、31970085)、国家重点研发计划(2018YFA0901400)、关键技术资助江苏省研发计划(BE2019630)，国家轻工技术与工程一流学科(LITE2018-16)的资助。

图1 期刊封面

图2 微生物法与动物组织提取法的比较

图3 毕赤酵母中硫酸软骨素合成示意图

图4 软骨素合成途径的构建与分析

图5 C4ST的表达与优化

图6 硫酸软骨素LC-MS图

图7 PAPS合成途径强化提高硫酸软骨素磺酸化水平

图8 3-L发酵罐分批补料发酵合成硫酸软骨素