欢迎来到糖化学与生物技术教育部重点实验室
徐沙
  2017-05-03  

姓名:        徐沙
职称:        副教授
研究领域: 生物工程、代谢工程、糖基化工程
E-mail:        xusha1984@jiangnan.edu.cn

教育经历:
2006/09-2011/06,江南大学,生物工程学院,工学博士
2002/09-2006/06,南京农业大学,食品科学与技术学院,工学学士

研究工作经历:
2013/12-2014/03,日本产业技术综合研究所,糖生物学研究中心,访问学者(合作导师:千叶靖典/Yasunori Chiba教授)
2012/02-2012/03,日本产业技术综合研究所,糖生物学研究中心,访问学者(合作导师:千叶靖典/Yasunori Chiba教授)
2011/08-至今,     江南大学,生物工程学院,副教授

主要研究背景及目标 

背景介绍:

糖蛋白(Glycoproteins)是由糖类分子与蛋白质分子通过共价结合形成的一类蛋白质。随着对人体代谢过程中糖蛋白生理功能的理解不断深入,糖蛋白药物的应用与开发受到越来越多的重视。2013年,在620种进入临床研究和临床前研究的候选药物中,有84种已经获得欧洲和美国有关机构的批准,其中68%是糖蛋白类药物。目前已有多种糖蛋白被批准用于治疗人类疾病,包括促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)、多种干扰素、血液凝结因子、癌症诊断标记物,以及单克隆抗体等[1]。以EPO为例,目前年生产能力超过600万支,年销售额超过60亿美元,远远超过其他类似生物技术药物,但其产量仍不能满足市场需求。

近年来,随着分子生物学和糖生物学的发展,通过适当的基因工程操作构建超糖基化缺陷型酵母,高甘露糖基化问题已得到基本解决,但是距离生产完全的人源化糖蛋白并用于工业生产仍然还存在较大差距,其关键原因在于:

其一,超糖基化缺陷型酵母对温度、pH、抗生素等环境因素变化高度敏感,生长缓慢、细胞易絮凝。申请人的前期研究表明,超糖基化缺陷型酵母的延滞期延长,基本观察不到对数生长阶段,稳定期菌体干重也仅为出发菌株的20%。此外,前期研究还发现,敲除超糖基化关键基因会导致酵母细胞壁甘露聚糖层缺陷,直接增加了细胞对环境变化的敏感性。因此,筛选生长回复的超糖基化缺陷型酵母突变株,是超糖基化缺陷型酵母用于工业生产过程所必需解决的首要问题。

其二,超糖基化缺陷型酵母的N-聚糖位点占有率降低。在酵母N-糖基化过程中,寡糖转移酶(Oligosaccharide transferase,OST)负责将寡聚糖转移到新生肽链的三联序列AsnXaaSer/Thr (NXS/T)中的天冬酰胺(Asn)残基上。真核细胞中,糖蛋白通常含有一个或多个N-糖基化位点,但并非每个潜在的N-糖基化位点都会被正确的糖基化。在超糖基化缺陷型酵母中,OST需要识别和转移的寡聚糖结构与野生型大为不同,极大的影响了转移效率,降低了其产物糖蛋白的N-聚糖位点占有率。研究表明,采用超糖基化缺陷型毕赤酵母生产的抗体蛋白,其N-聚糖位点占有率显著低于人类抗体[6]。由于大多数药物蛋白需要通过正确的N-糖基化修饰来保证其生理活性和在人血清中的稳定性[7],因此,如何在超糖基化缺陷型酵母中提高N-聚糖位点占有率,是实现酵母生产人源化糖蛋白的关键环节。

研究内容

(1)超糖基化缺陷型酿酒酵母的构建和新型高通量筛选N-聚糖位点占有率提高的超糖基化缺陷型酵母方法的建立。

酿酒酵母普遍拥有完整的糖基化系统,但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应呈超糖基化倾向。通过敲除α-1,3-甘露糖转移酶基因ALG3,糖基外侧链延伸的关键酶基因OCH1,和酵母特有的糖基化基因MNN1,构建糖链结构为Man5GlcNAc2的超糖基化缺陷型酿酒酵母。

将含有潜在N-糖基化位点的来源于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶,在上述超糖基化缺陷型酿酒酵母和出发菌株W303A中表达。在含有淀粉的培养基上分别点种培养,喷洒碘蒸气后比较透明圈大小和N-聚糖位点占有率之间的关系。初步建立一个基于透明圈/菌落直径比评价N-聚糖位点占有率的模型,用于内容3的研究。

(2)生长回复的超糖基化缺陷型酿酒酵母的构建和筛选。

Rho1p是葡聚糖合成酶复合体的一部分,可以激活β-1,3-葡聚糖合成酶的活性。过量表达RHO1基因可以提高细胞壁β-1,3-葡聚糖的含量,补偿超糖基化缺陷型酿酒酵母细胞壁甘露聚糖层的缺陷。采用透射电镜,观测重组菌的细胞壁甘露聚糖层和葡聚糖层的变化,与未表达Rho1p的菌株做比较。并进一步分析重组菌的细胞生长情况和对抗生素敏感性。

扩增来源于酿酒酵母AMY128-1的编码校对缺失DNA聚合酶δ基因,克隆到表达载体pYX212上,并转化超糖基化缺陷型的酿酒酵母,提高酵母基因组突变频率。在SD培养基上培养重组菌,逐步增大重组菌的培养体系以促进细胞分裂,然后将培养到稳定期的细胞收集并涂布在平板上,以温度敏感性和药物敏感性为标记来筛选具有明显生长回复突变的菌株。

(3)改造酵母寡糖转移酶(OST)提高超糖基化缺陷型酵母N-聚糖位点占有率。

OST对超糖基化缺陷型酵母N-糖链的识别能力较低。通过研究OST各亚基之间的调控关系,利用易错PCR对WBP1、OST2、SWP1和STT3等OST亚基基因进行随机突变。采用内容(1)建立的方法,筛选出5-10株N-聚糖位点占有率提高的超糖基化缺陷型酵母。并分析随机突变后WBP1、OST2、SWP1和STT3的基因序列,研究其突变位点和N-聚糖位点占有率之间的内在联系及其作用机制。

以分泌量大且检测方法简便的糖基化的鸡蛋清溶菌酶作为模型蛋白,分析其N-聚糖位点占有率的变化。将鸡蛋清溶菌酶基因在上述N-聚糖位点占有率提高的酵母菌株中表达,收集并浓缩其培养液,与改造前的酵母做比较。采用蛋白免疫印迹和质谱等技术测定培养液中鸡蛋清溶菌酶N-聚糖位点占有率的变化,并用酶标仪测定其酶活性,最终确定该菌株确实能够提高N-聚糖位点占有率。

研究目标
(1)运用基因敲除/过量表达、液相质谱等技术,构建和鉴定超糖基化缺陷型菌株并建立一种筛选N-聚糖位点占有率提高的超糖基化缺陷型酵母的方法。
(2)采用基因工程、透射电镜、适应性进化等技术手段,构建和筛选生长回复的超糖基化缺陷型酿酒酵母。
(3)利用目标(1)建立的方法和基因工程、蛋白免疫印迹、质谱和Sanger测序等技术手段,筛选得到N-聚糖位点占有率提高的超糖基化缺陷型酵母。

研究成果:

已发表论文如下:

1.       Xu S, Zhou Z, Du G, et al. Efficient transformation of Rhizopus delemar by electroporation of germinated spores. J Microbiol Methods. 2014, 103:58-63.

2.       Xu S, Wang X, Du G, et al. Enhanced production of L-sorbose from D-sorbitol by improving the mRNA abundance of sorbitol dehydrogenase in Gluconobacter oxydans WSH-003. Microb Cell Fact. 2014, 13:146.

3.       Xu S, Guo Y, Du G. Self-cloning significantly enhances the production of catalase in Bacillus subtilis WSHDZ-01. Appl Biochem Biotechnol. 2014, 173:2152-2162.

4.       Sha Xu, Jingwen Zhou, Liming Liu*, Jian Chen*. Water-forming NADH oxidase protects Torulopsis glabrata against hyperosmotic stress. Yeast. 2010, 27(4): 207-216.

5.       Sha Xu, Jingwen Zhou, Liming Liu*, Jian Chen*. Proline enhances Torulopsis glabrata growth during hyperosmotic stress. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2010, 15(2): 285-292.

6.       Sha Xu, Jingwen Zhou, Liming Liu*, Jian Chen*. Arginine: a novel compatible solute to protect Candida glabrata against hyperosmotic stress. Process Biochemistry. 2011, 44(6): 1230-1235.

7.       Yi Qin, Liming Liu, Changhao Li,Sha Xu, and Jian Chen*. Accelerating glycolytic flux of Torulopsis glabrata CCTCC M202019 at high oxiodreduction potential created using potassium ferricyanide.Biotechnology Progress, 2010, 26(6) :1551-1557.

技术支持:信息化建设与管理中心
校内备案号:JW备170140

地址:江苏省无锡市蠡湖大道1800号
邮编:214122
联系电话:0510-85912032
服务邮箱:netser@jiangnan.edu.cn